1. Estabelecendo o modelo BBB
Nota: Para estabelecer o modelo de barreira hematoencefálica (BBB), sugerimos o uso de células endoteliais microvasculares primárias do cérebro de rato (RBMECs) e astrócitos corticais de rato (RCAs) disponíveis comercialmente. Todas as etapas devem ser realizadas com reagentes estéreis e descartáveis manuseados em uma capela de fluxo laminar.
- Cultura de células
- Revestir os frascos de cultura de células com poli-L-lisina 100 μg/ml (1 hora à temperatura ambiente, RT) ou fibronectina 50 μg/ml (1 hora a 37 °C) para promover a fixação de RCAs ou RBMECs, respectivamente. Em seguida, descongele 1 x 106 RCAs e 5 x 105 RBMECs em meio de células endoteliais, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais e 1% de penicilina/estreptomicina (sECM). Semear RCAs em um balão T175 em 20 ml de sECM e RBMECs em um balão T75 em 10 ml de sECM.
Nota: As passagens de descongelamento e semeadura de RCAs e RBMECs devem ser ajustadas em termos de densidade celular e tempo de cultura de acordo com o número de condições experimentais a serem testadas com o modelo BBB. Começando com 1 frasco de 1 x 106 RCAs e 1 frasco de 5 x 105 RBMECs, é possível obter até 20 insertos com rolamento BBB.
- Manter as células a 37 °C e 5% de CO2 em atmosfera humidificada durante aproximadamente 6 dias até cerca de 80% de confluência para RCAs e mais de 90% de confluência para RBMECs. Separar as células com a solução de ácido tripsina-etilenodiamina tetracético (tripsina-EDTA) (tripsina 1:250) durante 5 min (1 ml de tripsina para frascos T75 e 2 ml para frascos T175). Interrompa a atividade da tripsina com sECM (2:1), centrifugue suspensões de células a 750 × g por 5 min e ressuspenda os grânulos em 60 ml de sECM.
- Dividir os RBMECs em 3 frascos T175 e cultivar em sECM por mais 3 dias antes de semear nas inserções. Conte o número total de RCAs vivos observando uma suspensão celular diluída 1:1 com azul de tripano sob um microscópio óptico em uma câmara de Burker.
- Semeadura de células em inserções
- Trate um lado da membrana de tereftalato de polietileno (PET) de 6 inserções transparentes de vários poços com poli-L-lisina 100 μg/mL e o outro lado com fibronectina 50 μg/mL, para permitir a fixação de RCAs e BMECs. Manuseie as inserções com uma pinça para evitar o contato com a membrana PET.
- Coloque as inserções em uma placa de 6 poços e adicione solução de fibronectina (mínimo 500 μl) na câmara superior. Após 1 hora de incubação a 37 °C, remova a solução de fibronectina, retire as inserções da placa de vários poços e coloque-as de cabeça para baixo no fundo de uma placa de Petri de150 cm 2, que é usada aqui como suporte estéril para as inserções já revestidas.
- Adicione suavemente 800 μl de poli-L-lisina na parte inferior do inserto (como mostrado na Figura 1A; referido como semeadura de RCAs) e mantenha a solução nos insertos por 1 hora em RT.
- Aspire a solução e deixe as inserções secarem em RT por 15-30 min. As pastilhas estão agora prontas para a semeadura celular, mas também podem ser armazenadas na placa de vários poços por vários dias a 4 °C antes de prosseguir com a construção do BBB.
Nota: Lembre-se de manter pelo menos 3 inserções revestidas livres de células para serem usadas como controles para validar o estabelecimento de BBB por medições de fluxo FD40.
- Semear RCAs (35.000 / cm2) na parte inferior das inserções revestidas com poli-L-lisina, deixando cair 800 μl de suspensão celular na inserção de cabeça para baixo (Figura 1A). Deixe a suspensão RCA nas inserções por 4 horas em RT para permitir a fixação eficiente das células à membrana.
- Aspirar a solução residual, colocar as inserções em alvéolos contendo 2 ml de sECM e manter a placa de vários poços a 37 °C e 5% de CO2 em atmosfera humidificada, trocando a sECM de 2 em 2 dias.
- Após 3 dias, quando os RCAs tiverem revestido a face inferior do inserto, semeie RBMECs no lado superior do inserto, seguindo estas etapas:
- Separar os RBMEC dos balões T175 e contar o total de células vivas, conforme indicado nos passos 1.1.2 e 1.1.3.
- Semear RBMECs (60.000 / cm2) na superfície superior do inserto em sECM (1.000 μl) (Figura 1B), deixando 3 insertos apenas com os astrócitos, para serem usados como fundo de resistência elétrica transendotelial (TEER). Coloque a placa de vários poços em condições de cultura padrão. Mantenha o sistema para cultura por pelo menos 3 dias, trocando o sECM na câmara interna e inferior a cada 2 dias.
2. Validação BBB
- Medição TEER
- No3º dia de co-cultura, verifique o TEER inserindo os insertos de rolamento BBB em uma câmara apropriada (com uma tampa e onde a câmara e a tampa contêm um par de eletrodos sensores de tensão e corrente), preenchida com 4 ml de sECM. Conecte a um volt/ohmímetro de tecido epitelial.
- Juntamente com as medições TEER dos sistemas BBB celulares, registre os valores TEER dos 3 insertos com os RCAs que serão subtraídos dos valores obtidos com os BBBs. Multiplique os valores TEER resultantes pela superfície do inserto (4,2 cm2) para expressar os resultados como Ω x cm2.
- A partir do3º dia de co-cultura, meça o TEER todos os dias. nota: Após um período inicial em que o TEER aumenta, os valores registrados devem permanecer estáveis por pelo menos dois dias consecutivos (geralmente entre o5º e o7º dia de cocultura). Nesse ponto, o BBB está pronto para a segunda etapa de validação (seção 2.2) e/ou para os experimentos trans-BBB.
Nota: O procedimento descrito no ponto 2.1 pode ser realizado nos mesmos sistemas BBB dedicados às seguintes experiências de permeabilidade (ponto 3). Opere em condições estéreis.
3. Permeação Trans-BBB de Ferritinas Carregadas com FITC (FnN)
Nota: Uma variante recombinante da ferritina humana (Fn), produzida em Escherichia coli e montada em nanogaiolas (FnN). FnN são carregados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), e as concentrações de Fn e das moléculas carregadas são determinadas com precisão.
- Fluxo Trans-BBB de FITC e FITC-FnN
- Medir o fluxo de FITC-FnN da câmara superior para a câmara inferior dos modelos BBB validados (geralmente no5º ao 7º dia de cocultura), em comparação com o do corante livre após 7 e 24 horas de incubação, de acordo com as seguintes etapas:
- Adicionar FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) ou uma quantidade igual de FITC livre na câmara superior de pelo menos 6 sistemas BBB para cada formulação, a fim de retirar 2 ml de solução sECM da câmara inferior de pelo menos 3 inserções após 7 horas e da câmara inferior de outras 3 inserções após 24 horas.
- Medir a intensidade de fluorescência de 500 μl das amostras recolhidas por espectrofluorómetro (λex 488 nm, λem 515 nm, fenda 5).
- Obter a fluorescência de fundo sECM medindo 500 μl de meio utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtraia a fluorescência de fundo sECM de todos os valores de fluorescência FITC ou FITC-FnN.
- Determinar a concentração de FITC ou FITC-FnN permeado comparando os valores de fluorescência obtidos com duas curvas de calibração diferentes produzidas com concentrações conhecidas (ou seja, 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) do corante livre ou nanoformulado dissolvido em 500 μl sECM.
