Medindo a atividade do proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares do cérebro de ratos

Abstract

Fonte: McFadden, T., et al. Quantificando a atividade subcelular da ubiquitina-proteassoma no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra como medir a atividade do proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares da amígdala lateral a partir de cérebros de ratos condicionados pelo medo e de controle usando um ensaio de peptídeo fluorogênico. O proteassoma cliva o substrato do peptídeo fluorogênico, liberando moléculas fluorescentes, que são quantificadas usando um leitor de placas para avaliar a atividade do proteassoma nas frações de proteínas nucleares e sinápticas. O aumento da atividade nuclear sugere mudanças na expressão gênica, enquanto a atividade sináptica reduzida indica a estabilização da proteína necessária para a manutenção da memória de longo prazo.

Protocol

1. Ensaio de atividade de proteassoma

NOTA: A atividade do proteassoma pode ser medida no tecido cerebral homogeneizado usando uma versão ligeiramente modificada do Kit de Atividade de Proteassoma 20S. Este ensaio não mede diretamente a atividade de complexos completos de proteassoma 26S. Em vez disso, ele mede a atividade do núcleo 20S, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do próprio núcleo, em oposição a todo o complexo de proteassoma 26S. O sucesso deste ensaio diminui com ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e/ou níveis crescentes de detergentes, particularmente iônicos, e requer o uso de um leitor de placas com um conjunto de filtros 360/460 (excitação/emissão) e capacidades de aquecimento de até 37 °C.

1. Configurações do leitor de placas: Pré-aqueça a 37 °C e mantenha durante toda a corrida.​
   1. Defina a excitação para 360 e a emissão para 460. Se a placa de 96 poços usada estiver limpa, defina a posição óptica para Inferior. Se uma placa escura/preta de 96 poços for usada, defina a posição óptica como Superior.
   2. Defina os modelos de leitor de placas mais antigos para Auto-Gain nas opções de leitura fluorescente; os modelos mais novos são predefinidos para isso. Programe uma corrida cinética com um tempo de 2 h, varrendo (leitura) a cada 30 min.
2. Reconstitua o tampão de ensaio 10x fornecido no kit com 13,5 mL de água ultrapura. Adicione 14 μL de ATP 100 mM ao tampão agora 1x; Isso aumenta significativamente a atividade do proteassoma nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio. O tampão final do ensaio 20S pode ser armazenado no gelo ou a 4 °C até que seja necessário e é estável por vários meses.
3. Reconstitua o padrão AMC fornecido no kit com 100 μL de DMSO. Execute esta etapa no escuro ou em condições de pouca luz, pois o padrão é sensível à luz.
4. Crie uma curva padrão de AMC usando o padrão reconstituído, no escuro ou em condições de pouca luz.
   1. Em tubos de microcentrífuga separados de 0,5 mL, adicione 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 μL do padrão AMC, o que corresponde a uma concentração de 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 μM de AMC.
   2. A esses tubos, na mesma ordem, adicione 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 μL de tampão de ensaio 20S. Isso cria uma série de concentrações altas a baixas de AMC, que serão usadas para calibração do leitor de placas e análise da atividade do proteassoma nas amostras homogeneizadas.
   3. Armazene todos os padrões diluídos no gelo no escuro até que sejam necessários.
5. Reconstituir o substrato de proteassoma (Suc-LLVY-AMC) fornecido no kit com 65 μL de DMSO. Execute esta etapa no escuro ou em condições de pouca luz, pois o substrato é sensível à luz. Crie uma diluição de 1:20 do substrato de proteassoma em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando tampão de ensaio 20S. Armazene o substrato diluído no gelo no escuro até que seja necessário.
   nota: Por exemplo, se a placa tiver 10 amostras e 1 branco, você precisará de substrato diluído suficiente para 22 poços (com duplicatas) a 10 μL por poço. Isso equivale a 220 μL de necessidade + 30 μL para erros de pipetagem, exigindo 12,5 μL de substrato e 237,5 μL de tampão de ensaio 20S.
6. Descongele as amostras desejadas (se congeladas) e adicione uma quantidade normalizada a uma placa de 96 poços. Execute cada exemplo em duplicatas. A quantidade de amostra necessária varia de acordo com a preparação do tecido. Geralmente, 10-20 μg é suficiente para qualquer fração subcelular.
7. Traga o volume do poço de amostra para 80 μL com água ultrapura. A quantidade adicionada depende do volume de amostra adicionada. Por exemplo, se a amostra 1 foi de 4,5 μL de proteína e a amostra 2 foi de 8,7 μL, então a quantidade de água necessária será de 75,5 μL e 71,3 μL, respectivamente. Em dois poços separados, adicione 80 μL apenas de água; estes serão os Ensaios em Branco.
   nota: Para limitar as mudanças no volume de proteína devido a erros de pipetagem, as concentrações de proteína podem ser normalizadas para a amostra menos concentrada. Isso permitirá o uso do mesmo volume de amostra em todas as condições.
8. Adicione 10 μL de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo os espaços em branco do ensaio. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para garantir um volume de ensaio consistente entre os poços.
9. Opcional: Nesta fase, introduza manipulações in vitro, se desejar; isso exigirá que cada amostra tenha 2 poços adicionais por tratamento, incluindo o veículo. Em caso afirmativo, adicione 5-10 μL de medicamento/composto de interesse a 2 dos poços de amostra e um volume equivalente de controle/veículo a outros 2 poços. Coloque a placa no leitor de placas pré-aquecido ou em uma incubadora a 37 °C por 30 min.
10. Apague as luzes ou entre em um quarto escuro. Adicione todos os 100 μL de padrões AMC diluídos a um novo poço; Cada padrão terá um único poço.
11. No escuro, adicione 10 μL de substrato de proteassoma diluído aos poços contendo amostras e ensaios em branco, mas não ao padrão AMC. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para garantir um volume de ensaio consistente entre os poços.
12. Coloque a placa no leitor de placas e inicie a execução cinética.
    nota: A placa não precisa estar sob agitação constante durante a corrida cinética, no entanto, o usuário pode optar por fazê-lo, se desejar
13. No final da execução cinética, exporte os valores fluorescentes 360/460 brutos para o Microsoft Excel.
    1. Calcule a média dos poços duplicados para cada padrão, cada amostra e o Ensaio em Branco para todas as 5 varreduras. Os valores fluorescentes brutos devem aumentar nas varreduras das amostras, mas permanecer estáveis (ou diminuir ligeiramente) para padrões e ensaios em branco.
    2. Pegue a média de poço padrão AMC mais alta e divida pela concentração conhecida (20 μM). Divida esse valor pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor AMC padronizado. Para cada amostra e média do ensaio em branco, divida pelo valor AMC padronizado.
    3. Pegue esse valor final e divida-o pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor normalizado para cada amostra e o Ensaio em branco. Faça isso para todas as 5 varreduras.
    4. Subtraia o valor normalizado do Ensaio em Branco de cada valor de amostra normalizado para todas as 5 varreduras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de atividade de proteassoma 20S	Millipore Sigma	APT280	Outros fornecedores carregam versões diferentes
ATP	pescador	FERR1441	Vários outros fornecedores
Leitor de placas BioTek Synergy H1	BioTek	VATECHH1MT3	Outros fornecedores carregam versões diferentes
Inibidor de Protease	Millipore Sigma	Pág. 8340	Vários outros fornecedores
Dmso	Dmso	D8418	Vários outros fornecedores