Medindo a atividade do proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares do cérebro de ratos

1. Ensaio de atividade de proteassoma

NOTA: A atividade do proteassoma pode ser medida no tecido cerebral homogeneizado usando uma versão ligeiramente modificada do Kit de Atividade de Proteassoma 20S. Este ensaio não mede diretamente a atividade de complexos completos de proteassoma 26S. Em vez disso, ele mede a atividade do núcleo 20S, o que significa que só pode servir como um proxy para entender a atividade do próprio núcleo, em oposição a todo o complexo de proteassoma 26S. O sucesso deste ensaio diminui com ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e/ou níveis crescentes de detergentes, particularmente iônicos, e requer o uso de um leitor de placas com um conjunto de filtros 360/460 (excitação/emissão) e capacidades de aquecimento de até 37 °C.

1. Configurações do leitor de placas: Pré-aqueça a 37 °C e mantenha durante toda a corrida.​
   1. Defina a excitação para 360 e a emissão para 460. Se a placa de 96 poços usada estiver limpa, defina a posição óptica para Inferior. Se uma placa escura/preta de 96 poços for usada, defina a posição óptica como Superior.
   2. Defina os modelos de leitor de placas mais antigos para Auto-Gain nas opções de leitura fluorescente; os modelos mais novos são predefinidos para isso. Programe uma corrida cinética com um tempo de 2 h, varrendo (leitura) a cada 30 min.
2. Reconstitua o tampão de ensaio 10x fornecido no kit com 13,5 mL de água ultrapura. Adicione 14 μL de ATP 100 mM ao tampão agora 1x; Isso aumenta significativamente a atividade do proteassoma nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio. O tampão final do ensaio 20S pode ser armazenado no gelo ou a 4 °C até que seja necessário e é estável por vários meses.
3. Reconstitua o padrão AMC fornecido no kit com 100 μL de DMSO. Execute esta etapa no escuro ou em condições de pouca luz, pois o padrão é sensível à luz.
4. Crie uma curva padrão de AMC usando o padrão reconstituído, no escuro ou em condições de pouca luz.
   1. Em tubos de microcentrífuga separados de 0,5 mL, adicione 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 μL do padrão AMC, o que corresponde a uma concentração de 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 μM de AMC.
   2. A esses tubos, na mesma ordem, adicione 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 μL de tampão de ensaio 20S. Isso cria uma série de concentrações altas a baixas de AMC, que serão usadas para calibração do leitor de placas e análise da atividade do proteassoma nas amostras homogeneizadas.
   3. Armazene todos os padrões diluídos no gelo no escuro até que sejam necessários.
5. Reconstituir o substrato de proteassoma (Suc-LLVY-AMC) fornecido no kit com 65 μL de DMSO. Execute esta etapa no escuro ou em condições de pouca luz, pois o substrato é sensível à luz. Crie uma diluição de 1:20 do substrato de proteassoma em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando tampão de ensaio 20S. Armazene o substrato diluído no gelo no escuro até que seja necessário.
   nota: Por exemplo, se a placa tiver 10 amostras e 1 branco, você precisará de substrato diluído suficiente para 22 poços (com duplicatas) a 10 μL por poço. Isso equivale a 220 μL de necessidade + 30 μL para erros de pipetagem, exigindo 12,5 μL de substrato e 237,5 μL de tampão de ensaio 20S.
6. Descongele as amostras desejadas (se congeladas) e adicione uma quantidade normalizada a uma placa de 96 poços. Execute cada exemplo em duplicatas. A quantidade de amostra necessária varia de acordo com a preparação do tecido. Geralmente, 10-20 μg é suficiente para qualquer fração subcelular.
7. Traga o volume do poço de amostra para 80 μL com água ultrapura. A quantidade adicionada depende do volume de amostra adicionada. Por exemplo, se a amostra 1 foi de 4,5 μL de proteína e a amostra 2 foi de 8,7 μL, então a quantidade de água necessária será de 75,5 μL e 71,3 μL, respectivamente. Em dois poços separados, adicione 80 μL apenas de água; estes serão os Ensaios em Branco.
   nota: Para limitar as mudanças no volume de proteína devido a erros de pipetagem, as concentrações de proteína podem ser normalizadas para a amostra menos concentrada. Isso permitirá o uso do mesmo volume de amostra em todas as condições.
8. Adicione 10 μL de tampão de ensaio 20S a cada poço, incluindo os espaços em branco do ensaio. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para garantir um volume de ensaio consistente entre os poços.
9. Opcional: Nesta fase, introduza manipulações in vitro, se desejar; isso exigirá que cada amostra tenha 2 poços adicionais por tratamento, incluindo o veículo. Em caso afirmativo, adicione 5-10 μL de medicamento/composto de interesse a 2 dos poços de amostra e um volume equivalente de controle/veículo a outros 2 poços. Coloque a placa no leitor de placas pré-aquecido ou em uma incubadora a 37 °C por 30 min.
10. Apague as luzes ou entre em um quarto escuro. Adicione todos os 100 μL de padrões AMC diluídos a um novo poço; Cada padrão terá um único poço.
11. No escuro, adicione 10 μL de substrato de proteassoma diluído aos poços contendo amostras e ensaios em branco, mas não ao padrão AMC. Um repetidor/pipeta automatizada é recomendado aqui para garantir um volume de ensaio consistente entre os poços.
12. Coloque a placa no leitor de placas e inicie a execução cinética.
    nota: A placa não precisa estar sob agitação constante durante a corrida cinética, no entanto, o usuário pode optar por fazê-lo, se desejar
13. No final da execução cinética, exporte os valores fluorescentes 360/460 brutos para o Microsoft Excel.
    1. Calcule a média dos poços duplicados para cada padrão, cada amostra e o Ensaio em Branco para todas as 5 varreduras. Os valores fluorescentes brutos devem aumentar nas varreduras das amostras, mas permanecer estáveis (ou diminuir ligeiramente) para padrões e ensaios em branco.
    2. Pegue a média de poço padrão AMC mais alta e divida pela concentração conhecida (20 μM). Divida esse valor pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor AMC padronizado. Para cada amostra e média do ensaio em branco, divida pelo valor AMC padronizado.
    3. Pegue esse valor final e divida-o pela concentração da amostra usada no ensaio para obter o valor normalizado para cada amostra e o Ensaio em branco. Faça isso para todas as 5 varreduras.
    4. Subtraia o valor normalizado do Ensaio em Branco de cada valor de amostra normalizado para todas as 5 varreduras.