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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Induzir anestesia
- Anestesiar o camundongo com cetamina (125 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) injetadas por via intraperitoneal.
2. Monitoramento de sinais vitais a cada 15 min
- Monitore a temperatura, a frequência respiratória e a cor da pele. O mouse deve estar quente ao toque. A pele deve parecer rosada e bem perfundida. A frequência respiratória deve variar de 50 a 70 respirações por minuto.
3. Procedimentos pré-cirúrgicos
- Pese todos os camundongos no dia anterior à indução da lesão.
- Esterilize um conjunto de instrumentos cirúrgicos em autoclavagem para cada sujeito experimental. Esterilize o dispositivo de impacto antes de usar.
- Prepare uma gaiola de recuperação colocando uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento elétrico ajustada para a configuração "baixa" e posicionada de forma que os ratos possam se afastar do calor uma vez ambulatórios.
- Configure a sala de cirurgia dentro de uma coifa de fluxo laminar esterilizada.
- Posicione a estrutura de operação estereotáxica.
- Fixe o dispositivo de impacto à estrutura estereotáxica.
- Defina o dispositivo de acionamento com os parâmetros biomecânicos desejados para velocidade e tempo de permanência.
nota: Neste protocolo, uma lesão cerebral grave é descrita utilizando uma ponta de impacto de 3 mm de diâmetro por meio de uma craniectomia de 5 mm de diâmetro com a velocidade ajustada em 2,5 m/s e um tempo de permanência de 0,1 s. Uma ampla gama de parâmetros biomecânicos pode ser usada para induzir todo o espectro de TCE.
- Coloque novos equipamentos de proteção individual e luvas estéreis.
- Raspe o pelo do local da operação usando uma tesoura elétrica.
- Aplique pomada oftálmica protetora nos olhos do camundongo para evitar lesões na córnea e ressecamento.
- Coloque o mouse na sala de cirurgia.
- Prepare a pele com um esfoliante cirúrgico à base de iodo alternado com álcool três vezes.
4. Aplicação de impacto cortical controlado
- Incisar o couro cabeludo 1 cm na linha média com um bisturi expondo o crânio.
- Posicione o mouse dentro de uma estrutura operacional estereotáxica, prendendo os ossos temporais bilaterais entre as barras auriculares em miniatura e travando os incisivos dentro de um grampo incisivo, criando uma fixação estável de três pontos na cabeça do mouse.
- Retraia o couro cabeludo para longe do local da operação com um hemostático ou pinça de travamento para garantir que o couro cabeludo não entre em contato com a broca durante a craniectomia.
- Identifique as suturas sagitais e coronais no crânio exposto.
nota: Este protocolo centraliza a craniectomia 2 mm à esquerda da sutura sagital e 2 mm rostral à sutura coronal.
- Realize uma craniectomia usando uma broca com uma broca de trefina.
- Para realizar a craniectomia, primeiro ative a broca na velocidade máxima e, em seguida, aplique a broca de trefina perpendicular ao crânio no local da craniectomia.
- Aplique uma pressão suave e uniforme na broca assim que o contato for feito com o crânio. Uma leve "cedência" será sentida assim que a broca penetrar no crânio. Não penetre na dura-máter
subjacente
nota: Este protocolo utiliza uma broca de trefina de 5 mm para realizar a craniectomia.
- Use uma pinça e uma agulha hipodérmica de pequeno calibre para remover o retalho ósseo, expondo totalmente a dura-máter subjacente.
- Gire a ponta do impactor para o campo operatório e abaixe-a até que entre em contato com a dura-máter exposta. Assim que o contato for feito, o sensor de contato do instrumento emitirá um tom audível para alertar o cirurgião de que o contato foi feito. Isso marcará o ponto zero a partir do qual a profundidade de deformação é definida.
nota: Este protocolo utiliza uma ponta de impacto de 3 mm para gerar uma lesão grave. Pontas tão pequenas quanto 1 mm podem ser usadas para aplicar lesões mais localizadas.
- Retraia a ponta de impacto e defina a profundidade de impacto desejada abaixando a posição do impactor na estrutura estereotáxica.
nota: Neste protocolo, descrevemos uma lesão grave definindo a profundidade de deformação para 2 mm.
- Aplique a lesão ativando o pêndulo no dispositivo de acionamento.
- Gire o dispositivo de impacto para fora do campo e remova o animal da estrutura estereotáxica.
5. Fechamento do sítio cirúrgico
- Controle o sangramento do crânio e da superfície cortical lesionada com pressão direta de um aplicador estéril com ponta de algodão.
- Seque o crânio com um aplicador estéril com ponta de algodão.
- Feche o couro cabeludo sobre a craniectomia usando um adesivo cirúrgico comercialmente disponível ou sutura monofilamentar.
nota: Neste protocolo, um adesivo cirúrgico veterinário é usado para fechar o couro cabeludo. O retalho ósseo não é substituído e é descartado.
6. Cuidados pós-operatórios e monitoramento
- Administre analgesia pós-operatória (por exemplo, buprenorfina de liberação sustentada 0,1–0,5 mg/kg administrada por via subcutânea, fornecendo 72 h de analgesia sustentada).
- Coloque o animal na posição de recuperação de decúbito lateral em uma gaiola limpa e pré-aquecida.
- Observe os animais até que estejam acordados e móveis e, em seguida, devolva cada rato à sua gaiola de origem.
- Garantir o livre acesso a alimentos e água. A ingestão normal de alimentos e água geralmente é retomada dentro de uma a duas horas após a lesão.
- Meça o peso corporal a cada três dias durante o experimento.