Obtenção de suspensões celulares de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos

Resumo

Fonte: Pösel, C., et al. Isolamento e Análise Citométrica de Fluxo de Células Imunes do Cérebro de Camundongo Isquêmico. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células cerebrais e células imunes infiltradas de tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos por digestão enzimática, seguida pela remoção de detritos celulares e mielina por centrifugação por gradiente de densidade, para estudar as respostas inflamatórias na pesquisa de AVC.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada.

1. Preparação de reagentes

1. Tampão de digestão (1 ml por hemisfério): Dissolva uma mistura padronizada de enzimas digestivas purificadas, por exemplo, Liberase com baixa concentração de termolisina (TL) para uma concentração de 2U / ml em Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) contendo cálcio (Ca) e magnésio (Mg).
2. Tampão de lavagem com DNAse: Dissolva DNAse I a uma concentração de 666U / ml em HBSS (Ca / Mg (cálcio / magnésio) livre) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS).
3. Tampão de lavagem sem DNAse: HBSS (livre de Ca/Mg) contendo 10% de FCS.
4. Meio de gradiente de densidade (5 ml por hemisfério): preparar o meio de gradiente de densidade isotónico (SIP; 100%) misturando nove partes de meio de gradiente de densidade com uma parte de cloreto de sódio 1,5 M. Dilua o SIP a 25% de densidade adicionando um volume apropriado de HBSS (livre de Ca/Mg) contendo 3% de FCS.

2. Dissociação do tecido cerebral em suspensões unicelulares

1. Remova cuidadosamente o tronco cerebral e o cerebelo com uma lâmina de barbear limpa. Use uma lâmina de barbear limpa para hemisseccionar o cérebro e corte cada hemisfério ao longo do plano coronal em três pedaços de tamanho aproximadamente igual.
2. Pique o tecido dissecado de cada hemisfério através de um filtro de células de 100 μm usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de 5 ml. Enxágue continuamente o filtro de células com HBSS gelado (+Ca/Mg). Armazene amostras homogeneizadas no gelo.
3. Centrifugue a 286 x g e 4 ° C por 5 min, descarte cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1 ml de tampão de digestão e transfira a suspensão para um tubo de 2 ml. Incubar a suspensão sob rotação lenta e contínua a 37 °C durante 1 hora.
4. Peneirar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm e enxaguar abundantemente com 3 ml de tampão de lavagem contendo DNAse seguido de 15 ml de tampão de lavagem sem DNAse. Centrifugar a 286 x g e 18 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. nota: O uso de DNAse elimina o muco do DNA causado pela lise celular, o que pode levar à agregação celular, comprometendo a sobrevivência celular.

3. Centrifugação com gradiente de densidade para remoção de mielina e detritos celulares

1. Ressuspenda o sedimento celular em 5 ml de meio gradiente de densidade de 25% e pipete a suspensão para um tubo de 15 ml. Misture bem por pipetagem repetida e suave, evitando a formação de bolhas. nota: O meio de gradiente de densidade deve ser usado em RT para evitar a aglomeração celular.
2. Centrifugue a 521 x g e 18 °C por 20 min. Use o perfil de aceleração mais baixo do rotor e deixe o rotor parar sem freio. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga sem agitar. Aspirar cuidadosamente o revestimento de mielina e o sobrenadante, preservando o sedimento celular no fundo do tubo. nota: Certifique-se de remover todo o revestimento de mielina, pois qualquer sobra prejudicará a análise de citometria de fluxo.
3. Ressuspenda o pellet em 10 ml de tampão de lavagem sem DNAse e pipete a suspensão para um novo tubo de 15 ml. nota: Esta etapa de lavagem é crucial, pois a remoção suficiente do meio de gradiente de densidade contribui significativamente para a quantidade e qualidade da amostra final da célula.
4. Centrifugar novamente a 286 x g e 10 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 100 μl de tampão de lavagem a frio e determine a contagem e a viabilidade das células por exclusão de azul de tripano em um hemocitômetro. Armazene as amostras a 4 °C e processe-as rapidamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rotador de tubos MACSmix	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Científico
Solução salina tamponada de Hank (HBSS)	Gibco/Life Technologies GmbH	Rolamento 14175-129
HBSS com Cálcio/Magnésio	Gibco/Life Technologies GmbH	Rolamento 24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostics GmbH	5401020001	Use em temperatura ambiente
Percoll Plus	GE Healthcare Europe GmbH	17-5445-01
Soro fetal bovino	PAN Biotech	3302-P101003
Azul de tripano	Gibco/Life Technologies GmbH	Rolamento 15250-061
Contagem de truzes	BD Biociências	340334
Solução salina tamponada com fosfato	Biochrom AG	L 182-10
DNase I	Roche Diagnostics GmbH	11284932001
Tubo de silicone, 1m	Instrumentos de precisão mundiais	503022
Tesoura de íris fina afiada / sem corte	Ferramentas de Belas Ciências	14028-10
Pinça reta de 1x2 dentes	Ferramentas de Belas Ciências	11021-14
Pinça de ponta romba	Ferramentas de Belas Ciências	11008-13
êmbolo de seringa de 5ml	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
Filtro de células, 100μm	Dr. I. Schubert, BD	2360-00
Seringa de dosagem fina Omnican 1ML	Braun	Tbd
Filtro de células, 70μm	Greiner Bio-One GmbH	Rolamento 542 070
pipetas sorológicas, 10ml	Greiner Bio-One GmbH	Nº 607180
pipetas sorológicas, 10ml	Sarstedt AG&Co	86,12,54,025
pipetas sorológicas, 25ml	Greiner Bio-One GmbH	Rolamento 760180
pipetas sorológicas, 5ml	Greiner Bio-One GmbH	Nº 606180
pipetas sorológicas, 25ml	Sarstedt AG&Co	86,16,85,020
pipetas sorológicas, 5ml	Sarstedt AG&Co	86,12,53,025
Pontas, 0,1-10μl	Ciências B.V.Life Corning	Nº 4840
Pontas, 100-1000μl	Greiner Bio-One GmbH	Rolamento 740290
Pontas, 10-200μl	Greiner Bio-One GmbH	739296
Tubos de reação 1,5ml	Greiner Bio-One GmbH	616201
Tubos de reação 2ml	Greiner Bio-One GmbH	623201
Placa de Petri bacteriológica, 94x16mm	Greiner Bio-One GmbH	Nº 633180
Falcão 15ml	Greiner Bio-One GmbH	188271
Falcão 50ml	VWR International GmbH (BD)	Rolamento 734-0448
Hemocitômetro de Neubauer	Biochrom AG	PDHC-N01
Lâmina	Carl Roth GmbH	CK07.1