Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de reagentes e suprimentos
- Determine o cloridrato de éster metílico de L-3,4-dihidroxifenilalanina (levodopa ou L-DOPA) e o cloridrato de benserazida, um inibidor periférico da descarboxilase (ver Tabela de Materiais), a frequência de classificação e o cronograma experimental apropriados para a questão investigativa (Figura 1).
nota: Perguntas investigativas podem ser feitas para buscar qualquer número de respostas, desde perguntar se uma terapia específica pode reduzir as discinesias induzidas por L-DOPA (LID) existentes até prevenir a indução de LID. Eles também podem explorar se a eficácia terapêutica depende da dose de levodopa ou se a expressão de LID e / ou eficácia terapêutica varia dependendo do sexo, espécie e idade do sujeito.
- Pese os ratos semanalmente para calcular a quantidade apropriada do medicamento com base nas mudanças de peso em andamento durante o estudo.
nota: Devido ao aumento da atividade em ratos LID+, há potencial para perda de peso com tratamentos de L-DOPA a longo prazo. Se ocorrer perda de peso, forneça aos ratos guloseimas nutricionalmente completas e altamente palatáveis (consulte a Tabela de Materiais) após injeções de L-DOPA.
- Calcule a quantidade de L-DOPA e benserazida necessária para cada concentração semanal, pesando alíquotas liofilizadas para cada dia de injeção e armazenando em combinação por 1–2 semanas a -20 °C em frascos de vidro âmbar até o dia do tratamento.
nota: A dose alvo é de 12 mg/kg ou 12 mg de L-DOPA/1000 g de peso corporal. Informações suplementares fornecem um exemplo de cálculos para determinar a quantidade de L-DOPA e solução salina necessária para cada dia da semana usando 12 mg de L-DOPA / kg de peso corporal em um volume de injeção de 1 cc / kg de peso de rato.
2. Configuração da sala e da gaiola
- No primeiro dia de tratamento com L-DOPA, 3-4 semanas após a cirurgia da lesão de 6-hidroxidopamina (6-OHDA), transfira os ratos para um alojamento único, incluindo enriquecimento aprovado pela IACUC.
- Mantenha em alojamento individual durante todo o estudo para evitar a interferência dos colegas nas avaliações comportamentais.
- Nos dias de classificação LID, coloque as gaiolas domésticas em uma gradinha de aço, girada em um ângulo de aproximadamente 45° para uma visualização ideal do rato (Figura 2A). Vire as etiquetas de identificação (Figura 2B) para cima e remova garrafas de água, prateleiras de alimentos e todos os tipos de enriquecimento na gaiola (Figura 2C) para evitar interferência nas avaliações comportamentais.
3. Injeções de levodopa e classificação de discinesia
- Injeções subcutâneas de L-DOPA
- Imediatamente antes da injeção diária de L-DOPA, adicione o volume apropriado de solução salina estéril à mistura de L-DOPA e benserazida liofilizada pré-pesada no frasco âmbar e agite bem por 10 s (passo 1.3).
NOTA: O volume alvo de injeção é de 1 mL / 1000 g de peso corporal (com 12 mg de L-DOPA por mL). O volume da solução salina estéril dependerá do número de animais por estudo.
- Encha seringas individuais (por exemplo, 1,0 ou 0,5 mL com agulha 26 G) com o volume necessário para cada animal (1 mL / kg de peso de rato) e rotule cada seringa com identificação individual do animal.
nota: Mantenha as seringas cheias protegidas da luz em bolsas estéreis até o momento da injeção. A L-DOPA oxida rapidamente na presença de oxigênio e luz em um ambiente aquoso.
- Traga a primeira gaiola para a bancada de injeção.
- Remova o rato de sua gaiola e coloque-o na superfície de injeção.
- Aperte suavemente a cabeça e os ombros contra a superfície em que o rato está descansando com a palma da mão não dominante.
- Esfregue suavemente a pele do dorso que cobre as escápulas com o polegar e o indicador da mão não dominante. Em seguida, injetar o volume de L-DOPA com a mão dominante no espaço subcutâneo entre/abaixo dos dedos, mantendo a agulha o mais paralela possível ao corpo para evitar a injeção intramuscular.
nota: Os ratos não são anestesiados antes da injeção.
- Descarte cada seringa individual usada em um recipiente afiado.
- Substitua o rato em sua gaiola individual e adicione guloseimas nutricionalmente completas, exceto nos dias de classificação LID para evitar interferência nas avaliações comportamentais até que as classificações sejam concluídas.
- Defina o cronômetro para 1–2 minutos, dependendo do tempo de classificação desejado e do número de ratos no estudo nos dias de classificação. Recupere a próxima gaiola e injete o próximo rato quando o cronômetro indicar.
- Repita isso, injetando um rato a cada 1–2 minutos, até que todos os ratos sejam injetados.
- Classificação de discinesia induzida por levodopa pós-injeção
- Classifique a intensidade (Tabela 1) e a frequência (Tabela 2) dos movimentos de discinesia distônica e hipercinética no número desejado de pontos de tempo, que devem incluir o início do comportamento da LIP, o comportamento de pico e a fase de declínio.
- Para ratos Sprague Dawley ou Fisher 344 adultos machos e fêmeas, e um tamanho de amostra de N = 40 ratos, inicie as classificações de discinesia 20 minutos após a primeira injeção de L-DOPA e, em seguida, em intervalos de 50 minutos até 220 ou 270 minutos após a injeção, dependendo de quando os comportamentos de LID foram interrompidos em 90% a 100% dos ratos.
- Se estiver usando intervalos de classificação de 1 minuto, defina um cronômetro para 1 minuto. Avalie o primeiro rato por um minuto. Passe para o próximo rato e classifique-o por 1 min. Continue por todos os ratos, classificando por intervalos de 1 minuto.
- Tenha um temporizador posicionado ao lado da gaiola de forma visível para que a intensidade do comportamento do LID (Tabela 1) possa ser observada ao estimar a frequência de qualquer comportamento (Tabela 2) durante o período de classificação.
- Depois que as classificações para o primeiro ponto de tempo forem concluídas, comece novamente com o primeiro rato no próximo ponto de tempo (por exemplo, 70 minutos após a injeção) e continue no intervalo desejado (por exemplo, a cada 50 minutos) até que todos os pontos de tempo sejam concluídos.
nota: Devido à sobreposição de tarefas de injeção de L-DOPA e classificação de LID, são necessárias duas pessoas nos dias de classificação, uma para injeção e outra para classificações comportamentais.
