Detecção de envelhecimento neuronal em uma seção organoide cortical

Resumo

Fonte: Shaker, M. R., et al. Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelagem da senescência neuronal cerebral in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o método de detecção de neurônios envelhecidos em seções organoides corticais por meio da coloração da atividade da beta-galactosidase, que é elevada em células senescentes. A enzima cliva um substrato para produzir um produto azul, seguido pela observação microscópica dos neurônios corados.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Caracterização do envelhecimento neuronal em organoides corticais

1. Organoides corticais de processo para criossecções:
   nota: As etapas foram realizadas em uma coifa de biossegurança Classe 2.
   1. Prepare 2 tubos de mL, cada um cheio de 1,5 mL de paraformaldeído a 4% (PFA).
   2. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P1000 (para torná-la um orifício largo) e transfira suavemente cada organoide para um dos tubos de 2 mL preparados acima (um organoide por tubo).
      nota: Para evitar que o excesso de meio de diferenciação (DM) se misture com o PFA, deixe o organoide afundar em direção à abertura da ponta da pipeta P1000 e apoie a ponta logo acima do topo do PFA no tubo antes de pipetar o organoide para fora. Isso permitirá que o pesquisador transfira apenas o organoide e o mínimo de mídia.
   3. Deixe o processo de fixação ocorrer a 4°C por 1 h.
   4. Usando uma ponta de pipeta P1000 sem cortes, aspire cuidadosamente o excesso de PFA e adicione 1,5 mL de PBS 1x frio (solução salina tamponada com fosfato).
   5. Transfira os tubos para um agitador orbital ajustado a 70 rpm por 10 min em temperatura ambiente (RT).
   6. Repita o processo de lavagem com PBS 1x frio três vezes para garantir que todo o PFA tenha sido completamente removido.
      nota: Não descarte o PFA em recipientes de lixo comuns; em vez disso, prepare um recipiente específico para descarte de resíduos químicos para isso, pois o PFA é um perigo.
   7. Mergulhe os organoides em 1x PBS contendo 30% de sacarose e incube a 4 °C até que todos os organoides tenham afundado no fundo do tubo.
      nota: O tempo necessário para os organoides afundarem depende de seu tamanho e idade. Organoides de três meses podem levar até 5 horas.
   8. Usando uma ponta de pipeta P1000 cortada e de diâmetro largo, transfira suavemente de três a cinco organoides para um molde de montagem contendo uma solução de montagem feita de 30% de sacarose e 100% de temperatura de corte ideal (OCT) média na proporção de 3:2.
   9. Use uma ponta de pipeta de 10 μL com o auxílio de um estereomicroscópio para orientar e posicionar os organoides em um padrão semelhante a uma grade.
   10. Coloque o molde em gelo seco para solidificar a solução de OCT de sacarose antes de prosseguir com o crioseccionamento (16-20 μm) usando um criostato.
       nota: Para a beta-galactosidase associada à senescência, todos os tecidos devem ser processados para seccionamento depois de afundados. Para imunofluorescência, os tecidos podem ser processados para seccionamento no dia seguinte. Se não forem coradas imediatamente, todas as lâminas que contêm secções devem ser conservadas a -20 °C antes da subsequente imunofluorescência ou beta-galactosidase.
2. Processo para análise da senescência nos organoides corticais cerebrais:
   nota: As etapas a seguir podem ser executadas em uma bancada de laboratório comum.
   1. Transfira as lâminas para um recipiente de coloração de lâminas de microscópio com tampa e lave o tecido organoide seccionado três vezes com 1x PBS por 10 min em RT para remover qualquer excesso de solução de montagem.
   2. Em seguida, incubar o tecido lavado com solução de coloração de beta-galactosidase recém-fabricada durante a noite a 37 °C.
      nota: A solução de coloração beta-galactosidase é feita de tampão fosfato (para 10 mL de tampão fosfato: 8,15 mL de 1 M NaH₂PO₄, 1,85 mL de 1M Na₂HPO₄) pH ajustado = 6, 100 mM de hexacianoferrato de potássio (III), 100 mM de hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado, 5 M de NaCl, 1 M de MgCl₂, 20 mg/mL de X-Gal. Evite usar uma incubadora de cultura de células padrão contendo CO₂, pois o CO₂ alterará o pH da solução de coloração beta-galactosidase.
   3. Para remover a solução de beta-galactosidase, lave os tecidos corados com 1x PBS três vezes por 10 min cada em RT.
   4. Monte os tecidos lavados com um suporte antidesbotamento de vidro e deixe a solução de montagem solidificar por 30 min em RT antes de visualizar ao microscópio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% Formaldeído (P/V) Sem metanol	Thermo Fisher Scientific	28908	4% do PFA são diluídos em 1x PBS
Microscópio CKX53 com câmera SC50	Olimpo
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Sigma Aldrich Pty Ltda	D1408-500ML
Médium Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Usado em mídia DM
Composto de incorporação OCT Sakura Clear (118 mL/frasco)	Tecido Tek	4583
Hexacianoferrato de potássio (II) trihidratado	Sigma Aldrich Pty Ltda	CP1087
Hexacianoferrato de potássio (III)	Sigma Aldrich Pty Ltda	455946
Prolongar o Mountant Antifade de Vidro	Tecnologias de Vida Austrália (TFS)	Pág. 36980
Sacarose	Sigma Aldrich Pty Ltda	PHR1001-1G	30% da sacarose são diluídas em 1x PBS