Convulsões induzidas pelo manuseio em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Batot, G., et al. Um modelo para epilepsia de etiologia infecciosa usando o vírus da encefalomielite murina de Theiler. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra a indução de convulsões induzidas pelo manuseio em um camundongo infectado com o vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV). O camundongo infectado, que possui neurônios hiperexcitáveis, é exposto a estímulos físicos externos. Essa exposição causa estresse, levando a uma atividade elétrica anormal nos neurônios, o que resulta em convulsões.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Inoculação de vírus

1. Esterilização da seringa para injeção
   1. Remova a tampa da seringa de insulina. Adicione um tubo de polietileno como um colar ao redor da agulha para garantir uma profundidade de injeção adequada de 2,5 mm. Mergulhe a seringa em etanol por 30 min. Coloque a seringa sob luz ultravioleta durante 30 min.
   2. Coloque a tampa de volta na agulha. Enrole a seringa em uma bolsa esterilizadora e feche-a com fita adesiva. Etiqueta com a data de preparação.
2. Injeção de vírus
   1. Obtenha alíquotas da cepa de TMEV de Daniel no freezer de −80 ° C. Descongele o vírus e mantenha-o no gelo. Evite descongelar e congelar novamente o vírus. Carregue a seringa com a suspensão do vírus (3 x 10⁵ unidade formadora de placa [PFU] diluída em 20 μL de solução salina tamponada com fosfato [PBS] ou meio de cultura Eagle modificado de Dulbecco [DMEM]).
      CUIDADO: O vírus é infeccioso para camundongos, mas não para humanos.
   2. Limpe a bancada com um desinfetante e trabalhe sob um absorvedor de fumaça. A inoculação do vírus não é estéril, mas é o mais limpa possível.
   3. Transfira o camundongo para a câmara de indução anestésica e use isoflurano a 2% em oxigênio para induzir a anestesia. Atingir a tolerância cirúrgica leva alguns minutos; Ajuste a concentração com base na respiração do animal e na profundidade da anestesia.
   4. Transfira o mouse anestesiado da caixa de anestesia sob o capô. Verifique a tolerância cirúrgica, por exemplo, beliscando o dedo do pé. Todo o procedimento é realizado em menos de 30 s, portanto, o animal não precisa inalar isoflurano durante a injeção. Adicione pomada para os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
   5. Limpe a cabeça do animal com uma compressa com álcool. Incline a cabeça do mouse ligeiramente para a esquerda para que o local da injeção fique apontando para cima.
   6. Puxe a pele um pouco para trás, insira a agulha na cabeça e injete 20 μL por via intracortical a uma profundidade de 2,5 mm na região temporal do hemisfério direito (posterior e medial ao olho direito).
   7. Realizar a injeção unilateralmente no mesmo hemisfério em todos os animais. Use o olho e o ouvido como pontos de referência para a localização do córtex parietal. A colocação foi previamente verificada histologicamente; veja Figura 1. As coordenadas de injeção de acordo com a injeção estereotáxica em relação ao bregma são −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
   8. Deixe a seringa no lugar por 5-15 s. Anote se há algum vazamento da injeção ou se forem vistas bolhas de ar - nesse caso, prepare uma nova seringa. Ao puxar cuidadosamente a seringa para fora, gire-a ligeiramente. Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   9. OPCIONAL: Codifique o animal na cauda ou na orelha, dependendo dos procedimentos locais (opcional, mas fácil, pois o animal está inconsciente).
   10. Transfira o animal para uma nova gaiola, que é colocada meio em/meio fora de uma almofada de aquecimento (35-40 °C) durante a recuperação da anestesia. Não deixe os animais sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
       NOTA: Os animais podem ser alojados em grupo novamente após a recuperação (animais infectados não são misturados com animais infectados simulados). Os camundongos infectados não devem ser alojados na mesma sala que os camundongos não infectados.
   11. Acompanhe o peso dos camundongos nos primeiros 7 dias após a infecção, pois eles perdem peso após a infecção e podem exigir alimentação adicional.

2. Monitorização das crises induzidas pelo manuseamento

1. Realize este procedimento por um experimentador cego para o tratamento. Traga todas as gaiolas para o banco. Observe os animais quanto a convulsões 2x ao dia durante a fase de luz.
2. Pontue a atividade convulsiva por uma escala de Racine modificada: 0 = sem mudança no comportamento, 1 = movimentos bucais e faciais, 2 = acenando com a cabeça, 3 = clônus unilateral do membro anterior, 4 = clônus bilateral do membro anterior com elevação, 5 = atividade tônico-clônica generalizada com perda do tônus postural, às vezes pulando, 6 = salto prolongado e excessivo e hiperatividade. Relate o número e a intensidade das convulsões.
3. Deslize uma caneta pela gaiola para fazer barulho.
4. Transfira cada animal para outra caixa e volte.
5. Agite suavemente a gaiola com um movimento para frente e para trás, tomando cuidado para não sacudir a gaiola com tanta força que os animais batam nas laterais ou no topo da gaiola e corram o risco de sofrer ferimentos físicos.
6. Monitore todos os animais na gaiola quanto a convulsões. A qualquer momento, se um camundongo tiver uma convulsão, transfira-o de volta para a gaiola doméstica e anote o nível da convulsão sem mais estimulação da convulsão por ruído ou manuseio.
7. Para animais que não apreenderam espontaneamente ou após uma sacudida suave da gaiola, desencadeie convulsões por meio de um manuseio mais intenso: Vire cuidadosamente o mouse virando-o na cauda da esquerda para a direita.
   NOTA: Animais com convulsões são hiperexcitáveis e podem ficar nervosos.
8. Observe cada animal quanto ao comportamento de convulsão novamente. Repita o processo para gaiolas subsequentes.

Resultados

Figura 1: Esquema do procedimento de injeção de TMEV. Da esquerda para a direita: Para uma injeção no córtex parietal direito, a agulha é injetada ligeiramente lateral de uma linha imaginária entre o olho e a orelha oposta. O colar para controle de profundidade é indicado em amarelo. O trato de injeção pode ser visto na seção coronal do cérebro, marcada pela seta. O local da injeção corresponde às co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equilíbrio animal	Ohaus (Parsippany, NJ, EUA)	STX2202	0.01 g–2200 g
Seringas de insulina BD Lo-Dose U-100	BD (Mississauga, Ontário, Canadá)	BD329461	Seringas estéreis Lo-Dose com agulha permanente BD Micro-Fine IV - 1 mL
A cepa de TMEV	gentilmente cedido por Robert Fujinami (Universidade de Utah)	-	3 x 105 alíquota(s) de unidades formadoras de placas
Desinfetante, por exemplo, VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Alemanha	-	Recomendado por veterinários do campus com menos ou igual a 5% de álcool
Almofada de preparação de álcool estéril médio Fisherbrand C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, EUA)	502017	Isoflurano 250 mL, 2%–5%
Absorvedor de fumaça	Labconco (Kansas City, MO, EUA)	-	-
Proteção Geral Descartáveis SMS Jalecos Brancos	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	17-100-810A
Balde de gelo	-	-	qualquer
Gaiola de rato	-	-	qualquer gaiola de rato contendo pelo menos 5 ratos
Agulhas PrecisionGlide	BD (Mississauga, ON, Canadá)	329652	Ponta deslizante BD com seringas de insulina de agulha PrecisionGlide - 26 G x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Bolsa de esterilização autovedante	Fisher Scientific (Hampton, NY, EUA)	NC9241087	12.6 x 25.5 cm
Frasco de vidro pequeno	-	-	qualquer, volume 25 mL
PBS estéril	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)	10010056
Seringa Luer-Lok	BD (Mississauga, Ontário, Canadá)	309628	Apenas seringa de 1 ml
Limpador Ultrassônico, Aquecedor/Temporizador Mecânico	Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, EUA)	EW-08895-23	Sonicador de banho - 0,5 gal, 115 V

de Daniel