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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Cirurgia de hemissecção torácica
- Use equipamento de proteção adequado (luvas, máscara e avental) para manter um ambiente asséptico para a cirurgia. Limpe a área cirúrgica com lenços umedecidos com álcool e coloque campos cirúrgicos estéreis sobre o campo cirúrgico. Esterilize as ferramentas cirúrgicas e coloque-as no campo cirúrgico.
- Anestesiar o rato sob uma mistura de gás isoflurano (indução a 3%, manutenção a 0,5−3%) e oxigênio (1 L/min). Confirme a profundidade anestésica cirúrgica adequada, verificando a ausência de pinça do dedo do pé e respostas reflexas da córnea. Monitore continuamente o rato durante todo o procedimento e ajuste a quantidade de administração de anestésico conforme necessário para manter a profundidade do anestésico cirúrgico.
- Raspe o tronco dorsal entre o quadril e o pescoço, coloque o rato no campo cirúrgico, desinfete o local da incisão com lenços umedecidos embebidos e solução de proviodo e mantenha a temperatura corporal central a 37 ° C usando uma almofada de aquecimento controlada por feedback monitorada por termômetro retal.
- Coloque pomada oftálmica nos olhos para mantê-los hidratados e reaplique durante a cirurgia, conforme necessário.
- Faça uma incisão de 2,5 cm na pele cobrindo as vértebras T6−T10 com um bisturi. Retraia a pele e a gordura superficial usando uma tesoura de dissecção romba.
NOTA: Os segmentos vertebrais T6−T10 podem ser identificados rostralmente pela palpação suave dos segmentos espinhais dorsais a partir da base do crânio a partir da protuberância perceptível da 2nd vértebra torácica ou caudalmente pela palpação da costela flutuante mais posterior, o que induzirá o movimento nas 13ª vértebras torácicas.
- Separe os músculos paravertebrais inseridos na face dorsal das vértebras T7−T9 usando uma tesoura de dissecção romba e um afastador auto-retentor. Desbride e limpe qualquer tecido remanescente usando pinças finas e aplicadores com ponta de algodão para expor os processos espinhosos e as lâminas vertebrais.
NOTA: Esta e as etapas a seguir são muito auxiliadas pela visualização microscópica (~5−15x).
- Corte cuidadosamente as facetas (articulações zigapofisárias) bilateralmente nas vértebras T7 e T8 com delicados aparadores ósseos. Corte o tecido conjuntivo dorsal entre as lâminas vertebrais T8 e T9 superficialmente com um bisturi (1 mm de profundidade) tomando cuidado para não ferir o cordão subjacente.
- Remova o processo espinhoso da vértebra T8 com aparadores ósseos. Com uma pinça hemostática curva cuidadosamente presa no processo espinhoso T7, gire a extremidade caudal das lâminas T8 levemente rostralmente (~20°), insira os aparadores ósseos sob a lâmina T8 e faça um corte na linha média que se estende ao longo da lâmina. Continue a laminectomia repetindo os cortes no lado esquerdo e direito da lâmina vertebral medial aos processos transversos para expor a medula espinhal.
NOTA: Tenha cuidado para remover todos os fragmentos ósseos criados a partir da laminectomia.
- Goteje lidocaína (2%, 0,1 mL) no canal vertebral exposto e remova a dura-máter que cobre o segmento espinhal T8 usando pinça fina e tesoura de iridectomia. Repita a administração de lidocaína no cordão exposto e identifique a linha média do cordão pela visualização de uma linha central criada entre os processos espinhosos que se estendem entre a vértebra T7−T9 exposta.
NOTA: Juntamente com os processos espinhosos em T7 e T9, os gânglios da raiz dorsal expostos em T8 também podem ser usados para auxiliar na identificação da linha média. Uma agulha de 30 G pode ser colocada na linha média do cordão para ajudar na hemissecção subsequente.
- Hemisseccione a medula espinhal da linha média para um lado com uma faca de dissecação. Tenha cuidado para não cortar a artéria espinhal anterior no lado ventral (não aplique pressão firme no corpo vertebral). Usando uma tesoura de iridectomia, corte cuidadosamente qualquer tecido remanescente no lado lesionado da medula espinhal para garantir que o quadrante ventrolateral seja adequadamente seccionado.
- Coloque uma esponja hemostática estéril embebida em solução salina (~ 6 x 2 mm) na cavidade exposta acima da medula espinhal e suture as camadas musculares (poliglactina 910 4-0). Em seguida, suture a pele ao redor do local da incisão.
- Forneça analgésico adequado (buprenorfina 0,05 mg/kg subcutâneo [s.c.]), antibiótico (enrofloxacina, 10 mg/kg s.c.) e reponha os fluidos perdidos com 5 cc de solução de Ringer com lactato (intraperitoneal [i.p.]) imediatamente após a cirurgia.
- Remova o rato da anestesia. Coloque o rato em um ambiente quente sob uma almofada de aquecimento ou lâmpada (~ 33 °C) até que o animal esteja totalmente acordado.
- Forneça analgesia suplementar diariamente durante os primeiros 3 dias pós-cirúrgicos e monitore continuamente os sinais de dor, perda de peso, micção inadequada, infecção, problemas com a cicatrização de feridas ou autofagia.