Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação da solução de lisofosfatidilcolina (LPC)
- Dissolva 25 mg de pó de LPC (ver Tabela de Materiais) com 250 μL de solução mista de clorofórmio e metanol (1:1) para fazer uma solução de LPC a 10% e transfira-a para um tubo de centrífuga de 500 μL.
NOTA: Se o LPC não estiver completamente dissolvido, coloque o tubo de centrífuga em um limpador ultrassônico e ultrassonice a 40 kHz por ~ 1 h para obter uma solução uniforme.
- Divida a solução em 3 μL / tubo e armazene a -80 ° C.
NOTA: A solução pode ser armazenada por ~ 2 anos.
- Antes da cirurgia, diluir a solução (etapa 1.2) com 27 μL de solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% e manter a solução em banho-maria de temperatura constante a 37 °C.
NOTA: Prepare a solução imediatamente antes de iniciar a injeção.
2. Preparo cirúrgico
- Use uma agulha de 32 G e 2 polegadas para conectar a uma seringa de 5 μL (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que a seringa de microlitros esteja desobstruída. Retire 5 μL de solução de LPC para preparar a injeção.
- Anestesiar o camundongo em uma câmara de indução conectada a um vaporizador de isoflurano com isoflurano a 3% misturado com oxigênio a 100% a uma taxa de cerca de 0,3 L/min.
- Confirme a profundidade da anestesia pela falta de reflexo de pinça do dedo do pé enquanto a respiração é suave.
- Raspe a cabeça do mouse entre as orelhas usando um barbeador elétrico. Aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante o procedimento.
- Em seguida, posicione o mouse em uma estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) com o lado dorsal para cima e prenda a cabeça com um cone de nariz e uma pinça de dente. Manter a anestesia com isoflurano a 1,2%-1,6% pelo nariz.
nota: A concentração de isoflurano pode ser ajustada de acordo com o estado respiratório dos camundongos.
3. Procedimento cirúrgico
NOTA: Os animais são colocados em uma almofada de aquecimento durante todos os procedimentos.
- Fixe o mouse ao aparelho estereotáxico com barras auriculares bilaterais. Certifique-se de que as barras auriculares estejam niveladas e a cabeça esteja horizontal e estável.
- Desinfete a pele da cabeça limpando-a várias vezes com iodóforo, seguido de álcool em movimentos circulares. Em seguida, um bisturi é usado para cortar uma pequena incisão de cerca de 1,5 cm ao longo da linha média do couro cabeludo para expor o crânio.
- Limpe o crânio com um cotonete embebido em peróxido de hidrogênio a 1% até que a bregma, lambda e fontanela posterior sejam expostas. Coloque a seringa no aparelho estereotáxico.
NOTA: Use peróxido de hidrogênio com cuidado e evite tocar nos tecidos circundantes.
- Garanta o posicionamento horizontal da cabeça do animal (frente e traseira e esquerda e direita).
- Ajuste o botão do eixo Z da estrutura estereotáxica para que a ponta da agulha e o crânio se toquem sem dobrar e, em seguida, meça a coordenada do eixo Z. Verifique as coordenadas Z de bregma e fontanela posterior.
- Ajuste a barra auricular de modo que a diferença entre as coordenadas Z do bregma e da fontanela posterior não seja superior a 0,02 mm. Em seguida, siga o mesmo método para medir as coordenadas Z das posições correspondentes nos lados esquerdo e direito da linha média. Ajuste a barra auricular para garantir que a esquerda e a direita estejam no mesmo nível.
- Localize o corpo caloso. Defina a origem XYZ como bregma.
NOTA: O primeiro local de injeção é 1,0 mm lateral ao bregma, 2,4 mm de profundidade e 1,1 mm anterior. O segundo local de injeção é 1,0 mm lateral ao bregma, 2,1 mm de profundidade e 0,6 mm anterior. Por exemplo, a coordenada do bregma é (0,0,0). Meça a coordenada Z do local correspondente marcado como (-1, 1,1, X) e (-1, 0,6, Y). Pode-se determinar que a coordenada do primeiro local de injeção do corpo caloso é (-1, 1,1, −[X + 2,4]), e o segundo local de injeção é (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
- Uma vez determinado o local da injeção, faça uma marca com um marcador estéril no crânio e registre as coordenadas.
- Perfure suavemente o local marcado com uma broca de crânio (consulte a Tabela de Materiais). Tome cuidado para evitar qualquer sangramento.
- Mova lentamente a agulha para as coordenadas indicadas e inicie a injeção. Para induzir a desmielinização do corpo caloso, injete 2 μL de solução de LPC (etapa 1.2) em cada local de injeção (etapa 3.5.) a uma taxa de 0,4 μL / min.
- Após a injeção, mantenha a agulha em cada local por mais 10 min.
NOTA: Certifique-se de que o intervalo de duas injeções não seja superior a 20 min.
- Suturar a pele com uma sutura 4-0 e esperar o animal acordar em 10 min. Administrar analgésicos no pós-operatório de acordo com as normas institucionais de cuidados com animais.
NOTA: O tempo recomendado para a eutanásia pode ser determinado de acordo com o objetivo do experimento.