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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de soluções de hemoglobina e LCR
- Prepare uma solução estéril de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) adicionando 500 μL da solução de aCSF a um microtubo de 1,5 mL e armazene no gelo.
- Prepare uma solução estéril de hemoglobina de 150 mg / mL adicionando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF em um microtubo de 1,5 mL e armazene no gelo.
2. Preparação do animal para injecção
- Gire a almofada de aquecimento para a configuração média para manter a temperatura corporal do rato.
- Anestesiar ratos pós-natais no dia 4 (P4) em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 3%
nota: Confirme a anestesia suficiente usando a resposta de pinça do dedo do pé/cauda a cada 15 minutos. Monitore a anestesia com observação visual da cor do tecido, temperatura corporal e frequência respiratória.
- Administre alívio da dor com uma injeção subcutânea de carprofeno de 5 mg / kg no rato anestesiado.
- Colocar o rato anestesiado em decúbito ventral no aparelho estereotáxico com o nariz posicionado no adaptador anestésico com fluxo constante de isoflurano a 1,5%.
- Aperte as barras auriculares sem ruptura no conduto auditivo externo para prender a cabeça.
nota: Aplique pomada veterinária para manter os olhos hidratados se os olhos estiverem abertos na idade da injeção.
- Limpe a cabeça, alternando com aplicadores estéreis com ponta de algodão embebidos em betadine e etanol 70%.
- Toque o aplicador embebido em betadine no centro do couro cabeludo e espalhe o betadine em círculos, movendo-se para fora.
- Repita a etapa 2.6.1.1 com o aplicador embebido em etanol.
- Repita a etapa 2.6.1.1 e a etapa 2.6.1.2 3x.
- Aplique um campo cirúrgico estéril para proteger o campo cirúrgico.
- Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de 0,3 cm verticalmente no centro da cabeça para expor o bregma do crânio.
nota: Se injetar do lambda, exponha o lambda do crânio em vez do bregma.
- Use um aplicador estéril com ponta de algodão para secar a área.
3. Configurando o injetor estereotáxico
- Aspire a solução de hemoglobina preparada na etapa 1.2 em uma seringa estéril de 0,3 mL com uma agulha 30G e coloque a seringa no sistema injetor estereotáxico.
nota: Se gerar condições de controle, aspire uma solução de LCR preparada na etapa 1.1 em uma seringa estéril de 0,3 mL e prossiga com o protocolo.
- Ligue a interface do injetor estereotáxico e clique no botão Configuração para inserir as configurações de volume e taxa de injeção.
- Clique em Volume e defina o volume em 20.000 nL (20 μL).
- Clique em Taxa de infusão e defina a taxa em 8.000 nL / min (8 μL / min).
- Saia da configuração clicando no botão Redefinir posição.
- Lave a ponta da agulha clicando no botão Infundir até que uma pequena gota de solução de hemoglobina surja na ponta da agulha.
- Absorva suavemente a solução de hemoglobina da ponta da agulha com um aplicador estéril com ponta de algodão.
4. Injeção de animais
- Defina o bregma como zero no sistema injetor estereotáxico ajustando as posições mediolateral e anteroposterior da seringa antes de abaixar a ponta da agulha da seringa lavada para tocar suavemente o crânio no bregma.
nota: Se estiver injetando do lambda, defina lambda como zero.
- Identifique as coordenadas de escolha.
- Se injetar a partir do bregma, em ratos P4 descritos aqui, use 1,5 mm lateral, 0,4 mm anterior e 2,0 mm de profundidade do bregma.
- Se injetar a partir do lambda, use as seguintes coordenadas para ratos P4: 1,1 mm lateral, 4,6 mm anterior e 3,3 mm de profundidade do lambda.
- Levante a agulha da seringa 1 cm acima do crânio para limpar o couro cabeludo. Quando a seringa for levantada, proceda ao ajuste das coordenadas mediolateral e ântero-posterior.
- Abaixe a agulha da seringa para tocar suavemente o crânio. Verifique se a agulha está tocando o crânio.
- Defina a coordenada dorsoventral ao longo de um período de 30 s.
nota: Ao definir a coordenada dorsoventral, a agulha perfurará o crânio. Deve-se tomar cuidado para garantir que a seringa passe pelo crânio sem deformá-lo. A deformação do crânio é evitada retirando lentamente a agulha ao longo da coordenada dorsoventral se ocorrer deformação e, em seguida, colocando a agulha de volta ao longo da mesma trajetória. Isso permite que a agulha passe pelo orifício no crânio com menos força e sem deformação.
- Na interface do injetor estereotáxico, clique no botão Executar para iniciar a injeção.
- Após o término da injeção, deixe a agulha da seringa no lugar por 2 minutos para minimizar o refluxo da solução.
- Retire a seringa lentamente ao longo da coordenada dorsoventral durante 2 min até que a ponta da agulha esteja 2 cm acima do couro cabeludo.
- Gire o braço injetor estereotáxico para longe do campo operatório.
5. Cuidados pós-operatórios
- Feche o couro cabeludo com uma sutura de monofilamento 6-0. Faça uma sutura simples interrompida no centro da incisão de 0,3 cm.
- Remova o filhote da anestesia e coloque-o em uma área segura na almofada de aquecimento.
- Retorne o roedor à gaiola de origem para se recuperar da anestesia sob os cuidados de sua mãe.
nota: O retorno oportuno aos cuidados da mãe reduz a mortalidade pós-operatória precoce.
- Monitore os animais para anestesia por perda do reflexo de endireitamento de hora em hora após a cirurgia por 3 h.
- Monitore os animais diariamente por 7 dias quanto à atividade normal, ingestão de alimentos e ganho de peso. Monitore o local da incisão quanto à cicatrização da ferida, fechamento e reaparecimento do pelo no local da cirurgia.
nota: No caso raro de alterações neurológicas, como convulsões, depressão central ou diminuição do apetite, serem observadas durante o monitoramento, eutanasiar o animal usando perfusão intravascular ou luxação cervical sob anestesia.
- Para evitar a infecção assim que a sutura estiver fechada e a ferida estiver cicatrizando, aplique antibiótico triplo tópico no local da incisão.