Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação para o ensaio de convulsão induzida pelo calor
- Ligue o botão Ligar na câmara de calor, seguido pelo botão Aquecer ligado.
- Defina a temperatura da câmara de calor em 50 °C usando o teclado do controlador digital de temperatura.
- Aguarde no mínimo 1 h para pré-aquecer a câmara a 50 °C antes de introduzir o primeiro rato na câmara. O pré-aquecimento garante um aquecimento uniforme dentro da câmara.
- Forre o chão da câmara de calor do rato com cama de espiga.
- Monte uma câmera de gravação de vídeo na frente da câmara de calor para registrar cada ensaio de convulsão induzido pelo calor.
- Forre uma placa de Petri de 140 mm de diâmetro com camadas grossas de papel de seda e coloque-a sobre o gelo para servir como uma almofada de resfriamento.
nota: No final do ensaio, os camundongos individuais serão transferidos para a almofada de resfriamento pré-resfriada para ajudar a reduzir a temperatura corporal elevada.
2. Preparando o camundongo para o ensaio de convulsão induzida pelo calor
- Selecione 10 camundongos adultos (P30-P40), 5 que carregam a mutação causadora de epilepsia e 5 dos companheiros de ninhada do tipo selvagem para ensaio de triagem de convulsão induzida por calor.
nota: Camundongos do tipo selvagem, sem abrigar nenhuma mutação causadora de epilepsia, não exibem convulsões induzidas pelo calor em temperaturas abaixo de 44 ° C e servem como grupo controle.
- Pesar cada camundongo a ser usado para o ensaio de triagem e registrar seu peso corporal. Apenas camundongos com peso igual ou superior a 15 g devem ser usados para o ensaio.
- Filtre um mouse de cada vez na câmara de calor do mouse.
- Anestesiar brevemente o mouse por 10-15 s usando algumas gotas de isoflurano no fundo de uma redoma de vidro.
- Retire o animal da redoma e coloque-o sobre uma toalha de papel.
- Certifique-se de que o mouse esteja completamente anestesiado, verificando se o mouse não responde a um beliscão nocivo do dedo do pé.
- Cubra a ponta de metal da sonda de temperatura retal com um lubrificante (como vaselina) e insira-a suavemente no mouse a uma profundidade menor ou igual a 2 cm.
- Prenda a sonda retal na cauda do mouse com fita adesiva para que a sonda não saia durante o ensaio.
nota: Como alternativa, coloque o animal em um cone de contenção de camundongos e insira a sonda de temperatura retal. Prenda-o prendendo-o na cauda.
- Certifique-se de que a sonda retal esteja conectada a um multímetro que exiba a temperatura corporal interna do mouse.
- Coloque o animal em uma gaiola fresca forrada com cama de espiga, ou seja, a gaiola de recuperação.
- Inicie um cronômetro e aguarde 5 min. Observe o mouse até que ele se recupere completamente da anestesia e o mouse esteja ativo e se preparando.
- Simultaneamente, monitore a temperatura corporal central do mouse até que ela se estabilize em 35-36 °C.
- Ao final de 5 min, observe a temperatura corporal do mouse. Esta é a temperatura corporal inicial no tempo "0" min.
nota: Se a temperatura corporal central do camundongo estiver abaixo de 35 ° C, aguarde mais tempo para que o animal se recupere da hipotermia induzida pela anestesia.
- Transfira rapidamente o mouse individual para a câmara do mouse pré-aquecida. Isso marca o INÍCIO do teste experimental. Apenas um mouse é rastreado por vez.
3. Ensaio de convulsão induzida por calor
- Depois de colocar suavemente o mouse no chão da câmara de calor pré-aquecida do mouse, feche a porta de acrílico e inicie a câmera para gravar o experimento em vídeo.
- Inicie o cronômetro. Registre a temperatura corporal do camundongo a partir do termômetro retal em intervalos de 1 minuto durante o experimento.
- Em intervalos regulares, aumente a temperatura da câmara de calor do camundongo de modo que a temperatura corporal do camundongo aumente a uma taxa de 0,25-0,5 °C /min.
nota: Aumentos rápidos na temperatura corporal podem levar à insolação ou morte e devem ser evitados.
- Seguindo este protocolo, aumente a temperatura da câmara de calor do camundongo em 5 °C a cada 10 minutos, conforme mostrado na Figura 1A.
- Aos 9.5 min, ajuste a temperatura da câmara de calor para 55 °C, para estabilizar a temperatura da câmara de calor para 55 °C até o 10º min, conforme mostrado no display digital de temperatura.
- Da mesma forma, aumente a temperatura para 60 °C a 19.5 min para estabilizar a temperatura da câmara de calor a 60 °C até o 20º min. Cada teste de triagem de convulsão dura 30 minutos.
- Se o camundongo tiver uma convulsão (vocaliza, mostra a cabeça balançando, clônus do membro anterior, extensão do membro posterior, cai de lado ou experimenta convulsões tônicas / clônicas generalizadas), registre as seguintes informações.
- Registre a temperatura corporal do camundongo durante a convulsão (temperatura do limiar de convulsão) a partir do termômetro de temperatura retal.
- Registre as características do comportamento convulsivo, como balançar a cabeça, clônus do membro anterior, extensão do membro posterior, queda de lado e / ou convulsões tônicas / clônicas generalizadas (GTCS) exibidas pelo mouse.
- Pegue o mouse da câmara de forma rápida, mas suave, e coloque-o na almofada de resfriamento preparada na etapa 1.6.
nota: Se um camundongo estiver experimentando convulsões na escala 5 de Racine e exibindo saltos descontrolados, pode ser difícil pegar o animal da câmara de calor e transferi-lo para a almofada de resfriamento do lado de fora. No entanto, uma convulsão típica induzida pelo calor dura entre 30 s a 60 s. Assim, o camundongo deve ser retirado da câmara de calor e colocado na almofada de resfriamento dentro de 60 s após o início do episódio de convulsão induzido pelo calor.
- Espere que a temperatura corporal do camundongo desça para 36-37 ° C, antes de transferi-lo para uma gaiola de recuperação. Apenas um mouse é colocado em uma gaiola de recuperação por vez.
nota: Não misture camundongos que ainda não foram usados para triagem induzida por calor com o camundongo que já passou pelo teste de experimento de convulsão induzida por calor.
- Gentil e cuidadosamente, corte a fita entre a cauda do mouse e o fio da sonda retal com uma tesoura para remover a sonda retal do mouse.
- Limpe a ponta de metal da sonda retal com álcool 70% e lenços umedecidos para mantê-la pronta para o próximo teste.
- Continue a observar o mouse na gaiola de recuperação até que ele retome a atividade normal (caminhar, limpar, etc.), antes de retornar o mouse à sua gaiola inicial. Isso marca o FIM do teste experimental para este mouse.
- Registar o estado do animal após o ensaio - vivo e recuperado da sessão de ensaio ou morto. Convulsões de alta intensidade envolvendo saltos descontrolados e convulsões tônicas/clônicas generalizadas às vezes podem resultar na morte do camundongo.
- Se um camundongo não tiver convulsões induzidas pelo calor dentro do período de observação de 30 minutos ou a temperatura corporal do camundongo atingir 44 °C, remova o camundongo da câmara de calor e coloque-o na almofada de resfriamento até que a temperatura corporal do camundongo retorne a 36-37 °C.
- Redefina a temperatura da câmara de calor do mouse para 50 °C e deixe-a equilibrar até que a temperatura do display no controlador digital de temperatura mostre 50 °C.
- Mude a cama de espiga entre testes individuais com camundongos.
