Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Coloração do anticorpo primário e biocitina
(Dia 1)
NOTA: O procedimento de imunocoloração a seguir é para seções flutuantes e requer agitação contínua em baixa velocidade (2 rotações/min, rpm) em um agitador para todas as etapas de incubação.
- Lave o lenço 3x por 10 min cada em 0,1 M PBS (pH = 7,4).
NOTA: 0,1 M PBS pode ser comprado comercialmente ou fabricado em laboratório da seguinte forma (faz 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 em 1 L de dH2O.
NOTA: Se o marcador neuroquímico desejado for conhecido, a coloração de uma proteína/peptídeo pode ser realizada simultaneamente com a coloração de biocitina (etapas 1.2 - 1.4). Se estiver colorindo apenas para biocitina, prossiga para etapa 1.5.
- OPCIONAL: Bloco com soro de bloqueio a 10% (BS; soro de cabra normal (NGS) diluído em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 1 h em RT).
NOTA: Cada poço deve receber o mesmo volume da solução; o volume recomendado está entre 250 - 500 μL/poço. A seleção do soro de bloqueio é baseada na espécie na qual os anticorpos secundários são criados ( por exemplo, NGS é usado para anti-cabra conjugado com corante (respectivas espécies de anticorpos primários)). Se for necessário utilizar anticorpos secundários criados em diferentes espécies para a imunocoloração, incluir 10% de cada soro normal na etapa de bloqueio (2) e 3% de cada soro normal para as etapas de incubação de anticorpos primários e secundários.
- (OPCIONAL) Incube as seções no anticorpo primário, CB1R (policlonal, cobaia), com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em 0,1 M PBS em RT O/N. CB1R é usado para identificar a expressão do receptor canabinóide tipo 1.
NOTA: Esta etapa é opcional e não é necessária para revelar o preenchimento de biocitina. A Figura 2 ilustra uma seção rotulada para biocitina e CB1R durante o primeiro processo de coloração. A incubação de O/N em RT é suficiente para a maioria dos anticorpos primários; no entanto, certos anticorpos primários, incluindo CB1R, requerem 3 - 5 dias de incubação. Se a incubação precisar ser maior que 1 d, recomenda-se incubar a 4 °C porque o Triton X-100 pode permeabilizar fatias e pode levar à desintegração do tecido durante a incubação prolongada à temperatura ambiente. Incluir um controlo negativo sem um anticorpo primário em pelo menos uma secção para cada série de experiências como controlo da especificidade do anticorpo secundário. Para controles negativos, o anticorpo primário é omitido, mas o Triton X-100 de 0,3% em PBS e BS 0,1 M são adicionados.
(Dia 2)
- Lave as seções cerebrais 3x por 10 min cada em 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incubar as seções em conjugado de corante vermelho de estreptavidina (concentração: 1:1.000; excitação: 594 nm com emissão no espectro vermelho visível) com 0,3% de Triton X-100 e 3% de BS em 0,1 M PBS a 4 ° C O / N no escuro (envolto em papel alumínio) para revelar a biocitina. OPCIONAL: Incluir um anticorpo secundário, anticobaia de cabra (concentração: 1:500; excitação: 488 nm e emissão a verde), com a incubação acima referida a seguir a incubação primária facultativa do passo 1.3.
NOTA: Um anticorpo secundário será necessário apenas se a coloração opcional do anticorpo primário (etapa 1.3) for realizada. Para visualizar a biocitina, recomenda-se um conjugado estreptavidina-fluoróforo com um espectro de emissão em vermelho, pois ajuda a visualizar axônios mais finos em detalhes e com melhor contraste (Figuras 1 - 3).
(Dia 3)
- Lave as seções cerebrais 3x por 10 min cada em 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Para proteger a fluorescência e facilitar a recoloração no futuro, monte as seções em um meio de montagem aquoso e sele as bordas da lamínula com esmalte transparente.
NOTA: É melhor repintar as seções o mais cedo possível para evitar dificuldades na remoção do esmalte da lâmina, infestação de mofo e desidratação do tecido devido ao vazamento do meio de montagem da lâmina de vidro. A contaminação microbiana pode ser evitada usando 0,02% de azida sódica em PBS.
CUIDADO: A azida sódica é altamente tóxica e inflamável quando está em contato com a água. Consulte os procedimentos operacionais padrão para o manuseio e descarte de produtos químicos perigosos.
(Dias 4 - 7)
- Realize imagens confocais com excitação em 594 e 488 nm e com uma ampliação de 20X ou 40X para revelar neurônios preenchidos com biocitina em vermelho e marcadores neuroquímicos (CB1R) em verde. Avalie a corotulagem (Figura 2).
- Defina a exposição da câmera para menos de 100 ms para evitar fotobranqueamento e obter pilhas de imagens confocais dos mandris axonais e dendríticos de todo o neurônio. Use pilhas de imagens confocais e pacotes de software de rastreamento de neurônios para reconstruir a morfologia neuronal.
