1. Preparação das Seções de Biópsias por Sucção Retal (RSB)
- Coloque as biópsias de sucção retal em paraformaldeído a 4% por 6 h para fixar o tecido. Use um volume fixador 5 vezes maior que o volume do tecido.
- Desidrate o tecido usando o desidratador de tecido patológico por 11 h. Todo o processo programado consiste nas seguintes 5 etapas:
- Coloque o tecido em formaldeído e fixe-o por 1 h.
- Coloque o tecido em etanol a 75% por 4 h.
- Colocar o tecido em etanol absoluto (duas trocas, 1 h cada).
- Colocar o tecido em etanol absoluto (duas trocas, 30 min cada).
- Colocar o tecido em xileno (três mudanças, 1 h cada).
- Colocar o tecido em cera de parafina (58-60 °C) (três mudanças, 1 h cada). Incorpore os tecidos RSB em blocos de parafina.
- Apare os blocos de parafina usando um micrótomo até que o tecido esteja totalmente exposto com um plano de corte completo.
- Corte os blocos em seções de 0,4 μm com um micrótomo.
- Coloque as seções em água a 45-50 °C por alguns segundos cada para permitir que as seções se espalhem em um prato plano.
- Transfira as seções de parafina para slides.
- Asse as lâminas em um forno a 60 ° C por 3-5 h. Evite assar por muito tempo, o que pode levar à perda dos antígenos.
- Coloque as lâminas desparafinizadas em xileno (2 trocas, 15 min cada).
- Hidrate as lâminas em etanol absoluto, etanol 95%, 80% e 75% por 5 min cada. Em seguida, enxágue-os em água purificada por osmose reversa (RO) por mais 5 min.
2. Recuperação de antígeno
- Faça diluições de trabalho para recuperação de calretinina misturando 4 mL de tampão de recuperação de antígeno de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) com 200 mL de água purificada por RO. Faça diluições de trabalho para a recuperação de S100 e Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) misturando 1 mL de tampão citrato de sódio de ácido cítrico (100x) com 99 mL de água purificada por RO.
NOTA: A calretinina pode ser recuperada preferencialmente por solução de recuperação de EDTA. No entanto, o tampão citrato de sódio de ácido cítrico é mais adequado para a recuperação de S100 e PGP9.5.
- Coloque as lâminas em um frasco de coloração de coplin. Encha o frasco com solução de recuperação e coloque-o em banho-maria fervente pré-aquecido. Depois de ferver por 20 min, retire o frasco do banho-maria e deixe esfriar até a temperatura ambiente. O processo de resfriamento leva aproximadamente 10 min. Remova as lâminas e enxágue-as suavemente uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Desenhe um círculo com uma caneta marcadora ao redor do tecido e prepare uma caixa úmida para os procedimentos a seguir.
3. Bloqueio
- Faça diluições de trabalho misturando 3 mL de 30% H2O2 com 27 mL de água purificada por RO.
- Coloque duas ou três gotas de solução de 3% de H2O2 gota a gota no tecido para bloquear as peroxidases. Adicione a solução H2O2 imediatamente para garantir que ela não transborde do círculo. Bloquear as peroxidases numa incubadora a 37 °C durante 20 min.
- Enxágue as lâminas suavemente com PBS (três lavagens, 5 min cada).
- Bloquear as lâminas por 20 min a 37 °C com albumina de soro bovino a 5% (BSA, preparada misturando 1,5 g de pó de BSA com 30 mL de água purificada por RO).
NOTA: O bloqueio com peróxido de hidrogênio a 3% pode prevenir 95% das colorações inespecíficas e o bloqueio com 5% de BSA pode prevenir os outros 5% das colorações inespecíficas. Combine os dois métodos para obter um resultado confiável.
4. Reação antígeno-anticorpo
- Remova o BSA 5% e adicione 50 μL de anticorpo primário (calretinina, S100 ou PGP9.5) à lâmina. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave a lâmina com PBS (três vezes, 3 min cada).
- Adicione 50 μL de intensificador de polímero (reagente A; consulte a Tabela de Materiais) à seção e incube-a por 20 min em uma incubadora a 37 ° C. Em seguida, lave a lâmina com PBS (três vezes, 3 min cada).
- Adicione 50 μL de anticorpo secundário B (anticorpo secundário IgG de cabra / coelho / camundongo) à seção e incube por 30 min em uma incubadora a 37 ° C. Lave a seção com PBS (três vezes, 5 min cada).
5. Coloração de 3,3-Diaminobenzidina e Hematoxilina
- Adicione 850 μL de água purificada por RO a um tubo de 1,5 mL e adicione os reagentes de coloração (consulte a Tabela de Materiais) nas ordens A, B e C. Adicione 50 μL de cada reagente para obter um total de 1 mL de solução de trabalho de 3,3-diaminobenzidina (DAB). Se houver precipitados, use a solução após a filtração.
- Adicione uma gota de solução de trabalho DAB à seção de tecido e core por 3-10 min. Incube as lâminas em DAB em temperatura ambiente até que seja detectada uma coloração marrom. Monitore cuidadosamente usando um microscópio de campo claro. Mantenha a solução de trabalho DAB longe da luz. Em seguida, lave a lâmina com PBS por 5 min.
- Adicione uma gota de hematoxilina para contra-corar os núcleos por aproximadamente 1 min. Em seguida, segure o frasco de coplin e lave-o com água por aproximadamente 30-40 s até que o excesso de corante seja removido. Tenha cuidado para não danificar as seções de tecido.
- Mergulhe as lâminas RSB em um frasco de coplin contendo PBS por 25-30 s. Em seguida, diferencie em ácido clorídrico-etanol a 1% por 10 s. Lave as lâminas com PBS por 1 min.
- Desidrate as lâminas na ordem inversa da hidratação: 75%, 80%, 95% e etanol absoluto (5 min cada).
- Exponha as lâminas ao xileno (2 trocas, 5 min cada).
- Monte a lamínula usando montagem ultralimpa. Deixe as lâminas secarem antes da visualização usando um microscópio.