Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de soluções de dissecção e líquido cefalorraquidiano artificial
- Carbogenar água ultrapura (que é filtrada com resistividade de 18,2 MΩ·cm) com carbogênio (95% O2/5% CO2) por 5 min usando difusores de bolhas de pedra de ar (aeradores para aquários).
nota: As pedras de ar podem ser conectadas ao regulador do tanque de carbogênio por meio de tubos de silicone padrão. Se as pedras de ar não estiverem disponíveis, feche a extremidade do tubo de silicone e faça pequenos orifícios na vedação para permitir que o gás carbogênio borbulhe e carbogene a solução.
- Preparar uma solução de dissecação dissolvendo os solutos da Tabela 1 em água ultrapura. Adicione CaCl2 a uma solução que foi carbogenada por pelo menos 5 min para ajudá-la a se dissolver.
nota: Como alternativa, adicione CaCl2 primeiro, para que possa se dissolver facilmente em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser de 300 a 320 mOsm/L e ter um pH de 7,4 após ser saturada com carbogênio.
- Resfrie a solução de dissecção a 0 - 4 °C. Deixe a solução na geladeira durante a noite ou coloque a solução no freezer por 1 h e monitore continuamente a temperatura.
nota: A solução de dissecção pode ser armazenada por até 3 noites; descarte depois.
- Carbogenar a solução de dissecção por 5 a 10 min antes de usar.
nota: Idealmente, a solução deve aparecer como lama ou fazer a transição para lama antes do uso.
- Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial para roedores (ACSF) dissolvendo os solutos da Tabela 2 em água ultrapura. Carbogenar a solução de ACSF em banho-maria aquecido a 35 °C até à utilização. Adicione CaCl2 a uma solução que foi carbogenada por pelo menos 5 min para ajudá-la a se dissolver.
nota: Como alternativa, adicione CaCl2 primeiro para que ele possa se dissolver mais facilmente em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser de 290 - 320 mOsm/L e ter um pH de 7,4 após ser saturada com carbogênio. As soluções devem ser feitas em volumes de 1, 2 ou 4 L, dependendo da duração dos experimentos. Faça 4 L para um dia inteiro (8 h) de experimentos. O ACSF deve ser feito fresco todos os dias; Não o armazene por mais de 1 d.
2. Dissecção de camundongos para coleta de tecido cerebral
- Reúna todas as ferramentas e materiais necessários para dissecações de animais. Configure o espaço de trabalho para se preparar para dissecações de animais.
- Verifique o tanque de carbogênio (95%O2/5%CO2) para garantir que não esteja vazio. Substitua o cilindro de gás antes dos experimentos se houver menos de 500 psi de pressão restante.
- Calibre o vibratomo (cortador de tecido de lâmina vibratória) de acordo com o manual de instruções do fabricante. Ajuste a configuração do vibratomo para ter uma amplitude de corte de 1 mm e uma velocidade de corte de 0.12 mm/s.
nota: As configurações ideais podem diferir para cada cortador de lâmina de tecido vibratório individual; No entanto, em geral, a amplitude deve ser alta e a velocidade de corte deve ser baixa.
- Encha a câmara de incubação da fatia do cérebro (ou seja, o guardião da fatia do cérebro) com ACSF e borbulhe-a com carbogênio. Em seguida, colocar a câmara de incubação num banho-maria regulado para 35 °C.
- Obtenha um camundongo juvenil de ambos os sexos, entre 13 e 21 dias (p21, onde p0 é a data de nascimento).
- Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (55 mg/kg de peso corporal). Uma vez que o camundongo esteja profundamente anestesiado, conforme indicado pela ausência do reflexo de pinça do dedo do pé, use imediatamente uma guilhotina aprovada pelo veterinário para decapitar o camundongo em um movimento rápido.
nota: Preparar a injeção de pentobarbital sódico de acordo com os procedimentos recomendados pelas diretrizes institucionais.
- Segure o nariz do camundongo para estabilizar a cabeça decapitada e faça suavemente uma incisão na linha média começando entre os olhos do camundongo e ao longo de todo o comprimento do couro cabeludo para expor o crânio. Certifique-se de que o crânio não seja comprimido pela pressão aplicada pela navalha. Use o canto do fio da navalha para aumentar a precisão do corte.
- Afaste as abas do couro cabeludo do camundongo usando os dedos para expor o crânio. Em seguida, use o canto fresco do fio de uma navalha para fazer uma incisão ao longo da linha média do crânio; Preste muita atenção para evitar qualquer contato com o córtex cerebral.
- Insira uma pinça de lasca nas órbitas oculares do camundongo para estabilizar a cabeça decapitada e coloque-a em uma placa de Petri cheia de solução de dissecação fria (0 - 4 ° C). Certifique-se de que a cabeça esteja totalmente submersa na solução de dissecação.
- Use um segundo conjunto de pinças de lascas para descascar suavemente o couro cabeludo do camundongo, remova o osso do nariz descascando-o e remova a parte de trás (lado caudal) do crânio.
nota: O osso do nariz de camundongos juvenis é muito macio e facilmente quebrado.
- Use uma microespátula para cortar os nervos ópticos, os nervos trigêmeos e a medula espinhal. Em seguida, use a micro espátula para separar suavemente o cérebro do crânio. Deixe o cérebro totalmente submerso na placa de Petri cheia de solução de dissecação.
3. Preparação de cortes corticais do córtex somatossensorial-motor
- Encha a bandeja tampão do vibratomo com ~150 mL de solução de dissecção fria (0 - 4°C).
nota: Opcionalmente, mantenha a bandeja tampão no freezer até que seja necessário para manter uma temperatura baixa durante o procedimento de fatiamento.
- Cole o tecido cerebral do mouse no estágio de vibratomo (suporte / bandeja de amostra) usando cola adesiva instantânea. Para camundongos, corte uma pequena porção caudal do cérebro (ou seja, o cerebelo) para que possa ser facilmente colada no suporte da amostra (permitindo que o lado rostral do cérebro fique voltado para o teto).
nota: Alternativamente, fatias horizontais de cérebro de camundongo podem ser preparadas colando o lado dorsal do cérebro no suporte da amostra (o lado ventral do cérebro deve estar voltado para o teto).
- Coloque suavemente o suporte da amostra (com tecido cerebral) na bandeja tampão. Certifique-se de que a porção dorsal do cérebro esteja voltada para a lâmina do vibratome.
nota: É fundamental minimizar a quantidade de tempo que o cérebro fica exposto ao ar.
4. Secção e coleta de tecido cerebral
- Corte o cérebro em fatias de 450 μm de espessura usando o vibratomo na direção dorsal para ventral. Certifique-se de que o cérebro permaneça completamente ancorado na bandeja de amostras enquanto a corta.
- Faça o primeiro corte no cérebro do camundongo para remover o bulbo olfatório. Em seguida, fazer cortes subsequentes até que seja observada a área somatossensório-motora (localizada aproximadamente a meio caminho entre o bulbo olfatório e o bregma).
nota: Opcionalmente, corte o cérebro em fatias mais finas (200 μm) até que o corpo caloso apareça na visão coronal do cérebro, o que indica que a área somatossensorial-motora está próxima.
- Utilizar uma pipeta de transferência de furo largo para recolher as fatias coronais (450 μm) que contêm a zona somatossensório-motora e mergulhá-las numa placa de Petri contendo uma solução de dissecação fria (0 - 4 °C).
- Use uma nova lâmina de barbear e corte o excesso de tecido das fatias. Para cortes coronais de camundongos, faça um corte transversal logo abaixo da comissura neocortical (ou seja, corpo caloso). Não corte em movimento de serra; Basta aplicar pressão na lâmina no tecido e usar um pincel de detalhamento para separar suavemente o tecido. Certifique-se de minimizar o movimento da fatia coronal.
- Use uma pipeta de transferência de furo largo para transferir a porção dorsal das fatias coronais que contêm o neocórtex (camada 1 - 6) para uma segunda placa de Petri preenchida com ACSF quente (35 ° C) por um momento (~ 1 s). Em seguida, transfira imediatamente as fatias para uma câmara de incubação contendo ACSF carbogenado quente (35 °C).
nota: O objetivo da transferência para a placa de Petri com ACSF é minimizar a transferência da solução de dissecção para a câmara de incubação durante a transferência de fatias de cérebro com a pipeta de calibre largo. Utilize os vários poços da câmara de incubação para manter as diferentes fatias do cérebro organizadas.
- Descarte o restante do cérebro e da carcaça do animal de acordo com as diretrizes institucionais.
5. Incubação e manutenção
- Deixar as fatias de cérebro ligeiramente submersas na câmara de incubação a 35 °C durante 30 min. Em seguida, retirar a câmara de incubação do banho-maria e deixá-la voltar à temperatura ambiente (20 - 25 °C). Aguarde 1 h para que as fatias cerebrais se recuperem antes de realizar os registros eletrofisiológicos.
nota: Certifique-se de que não haja bolhas de ar que se acumulem sob as fatias do cérebro na câmara de incubação. Bolhas de ar são interfaces de ar que causam danos aos tecidos. As fatias de cérebro de camundongo podem ser mantidas por 6 a 8 h em uma câmara de incubação bem carbogenada com ACSF.
6. Registros eletrofisiológicos da camada cortical superficial
Nota: Eventos ictais são observados nos registros de potencial de campo local extracelular (LFP) de fatias de cérebro. O LFP da fatia do cérebro pode ser observado e registrado com uma câmara do tipo interface ou um sistema de matriz de múltiplos eletrodos submersos (MEA).
- Use uma pipeta de transferência de furo largo ou um pincel de detalhamento para mover uma fatia de cérebro para um papel de lente pré-cortado um pouco maior que é mantido no lugar usando uma pinça dental. Transfira o papel da lente (sobre o qual a fatia do cérebro está apoiada) para a câmara de gravação e prenda-o na posição com uma tela de harpa.
- Perfusato de ACSF carbogenado quente (35 ° C) através da câmara de registro sobre a fatia do cérebro a uma taxa de 3 mL / min (~ 1 gotejamento / s). Use um termômetro digital para garantir que a câmara de registro esteja de 33 a 36 ° C.
- Puxe eletrodos de vidro com impedância de 1 - 3 MΩ da tubulação de vidro borossilicato (com diâmetro externo de 1,5 mm) usando um extrator. Encha os eletrodos de vidro com ACSF (~ 10 μL) usando uma seringa Hamilton. Descarte imediatamente o eletrodo se a ponta estiver danificada.
nota: Alvejar o fio de prata (5 min) e permitir que apenas uma porção mínima (ou seja, a ponta) do fio de prata seja submersa nos eletrodos de vidro cheios de ACSF para minimizar o ruído e o desvio durante as gravações. Remova qualquer excesso de ACSF do eletrodo de vidro com uma seringa Hamilton, se necessário.
- Use um microscópio estéreo 20X para guiar com precisão o eletrodo de vidro de gravação na camada cortical superficial (2/3) usando manipuladores manuais. Registre/visualize a atividade elétrica da fatia cerebral em um computador com software padrão.
nota: Fatias de cérebro viáveis (de alta qualidade) exibirão um potencial evocado robusto em resposta aos estímulos elétricos aplicados (100 μs, 30 - 300 μA) ou pulsos de luz (30 ms, 10 mW / mm2) para tecido optogenético.
7. Indução de atividades semelhantes a convulsões
- Perfundir ACSF contendo 100 μM de 4-aminopirimidina (4-AP) sobre a fatia do cérebro. Dissolva 80 mg de 4-AP em 8,5 mL de água para fazer uma solução estoque de 100 mM 4-AP. Adicione 100 μL de solução estoque 100 mM 4-AP a 100 mL de ACSF para obter um perfusato de ACSF com 100 μM 4-AP.
nota: Em alternativa, utilizar Zero-Mg2+ ACSF (Tabela 3), uma solução ACSF modificada sem adição de Mg2+, para perfundir a fatia do cérebro. O tempo médio para o aparecimento de eventos ictais é de 15 min; no entanto, pode levar até 40 minutos para algumas fatias de cérebro.
8. Geração de convulsões sob demanda: uma estratégia optogenética para camundongos optogenéticos
- Aplique um pulso breve (30 ms) de luz azul (470 nm) (com uma intensidade de saída mínima de 1 mW / mm2) para iniciar um evento ictal. Use um manipulador manual para posicionar uma fibra óptica de 1.000 μm de diâmetro do núcleo (0,39 NA) diretamente acima da região de gravação.
nota: Defina a taxa da fotoestimulação para corresponder à taxa desejada da ocorrência do evento ictal (ou seja, 1 pulso a cada 50 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada em relação à taxa intrínseca na qual os eventos ictais ocorrem.
Tabela 1: Receita para solução de dissecção.Estas são instruções para fazer volumes de 1 L ou 2 L. MW = massa molecular do soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | sacarose | 248 | 342,3 | 84.89 | 169,78 |
| algarismo | Bicarbonato de sódio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Dextrose (D-glicose) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Cloreto de potássio (KCl) | algarismo | 74,55 | 0,15 | 0,3 |
| 5 | Sulfato de magnésio (MgSO4 · 7H2O) | 3 | 246,47 | 0,74 | 1,48 |
| 6 | Fosfato de sódio monobásico mono-hidratado (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137,99 | 0,17 | 0,34 |
| 7 | Cloreto de cálcio (CaCl2 · 2H2O) | 1 | 147.01 | 0,15 | 0,29 |
Tabela 2: Receita de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) de roedores.Estas são instruções para fazer volumes de 2 L ou 4 L. MW = massa molecular do soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloreto de sódio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| algarismo | Bicarbonato de sódio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrose (D-glicose) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloreto de potássio (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnésio (MgSO4 · H2O) | 1.3 | 246,47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloreto de cálcio (CaCl2 · 2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,44 | 0,88 |
Tabela 3: Receita de líquido cefalorraquidiano artificial para roedores Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF).Estas são instruções para fazer volumes de 2 L ou 4 L. MW = massa molecular do soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloreto de sódio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| algarismo | Bicarbonato de sódio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dextrose (D-glicose) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloreto de potássio (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnésio (MgSO4 · H2O) | Nominalmente Livre | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloreto de cálcio (CaCl2 · 2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,29 | 0,59 |