Estabelecendo um modelo de crise epiléptica induzida por pentilenotetrazol em camundongos

Resumo

Fonte: Shimada, T., et al. Modelo de camundongo induzido por pentilenotetrazol. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o processo de indução de epilepsia em camundongos usando injeções de pentilenotetrazol (PTZ), um antagonista do receptor GABA-A. A administração intraperitoneal repetida de PTZ reduz progressivamente o limiar convulsivo, inibindo o influxo de íons cloreto, interrompendo a neurotransmissão inibitória e levando à hiperexcitabilidade nos neurônios que desencadeiam convulsões. Esse processo resulta em inflamações e no desenvolvimento de convulsões espontâneas, imitando a epilepsia crônica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de Pentilenotetrazol (PTZ)

1. Dissolver 2 mg/mL de PTZ em NaCl estéril a 0,9% (p/v). Prepare o PTZ no dia do uso.

2. Injeção de PTZ

1. Realize todos os experimentos entre 9h00 e 12h00 (meio-dia).
2. Meça o peso corporal do animal.
3. Coloque o animal em uma câmara de observação para habituação.
4. Durante o período de habituação (3 min), calcule o volume de solução PTZ para a injeção com base no peso corporal do animal e na dose de injeção previamente determinada.
   NOTA: Por exemplo, quando 35 mg/kg de PTZ é usado, 0,875 mg de PTZ é necessário para um camundongo pesando 25 g (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Portanto, 437,5 μL de uma solução de PTZ 2 mg / mL devem ser injetados (0,875 mg / 2 mg / mL = 0,4375 mL). A dose de injeção de PTZ depende do genótipo e da estirpe do ratinho. Para camundongos C57BL/6 do tipo selvagem, recomenda-se uma dose de 30-35 mg de PTZ/kg de peso corporal para o primeiro ensaio. A sensibilidade ao PTZ depende da cepa do camundongo usada. A dose de injeção varia de acordo com o objetivo do experimento.
5. Injete PTZ por via intraperitoneal com uma seringa de 1 mL conectada a uma agulha de calibre 27 no quadrante esquerdo ou direito do abdômen do animal. Evite injetar na linha média.
   1. Evite injeções repetidas na mesma posição.
6. Observe o comportamento dos animais por 30 minutos após a administração de PTZ (Figura 1A) e classifique e pontue o comportamento anormal conforme mostrado abaixo. Se possível, manter os animais sob observação durante 24 horas ou, pelo menos, mais 6 a 10 horas após a injeção, especialmente quando a pontuação de gravidade das crises atingir 3 ou mais.
   1. Observe quaisquer convulsões leves ou alterações comportamentais nos animais além do período de observação de 30 minutos. Este período de observação prolongado pode abordar um efeito particularmente importante e completo de uma dose subconvulsiva de PTZ na geração de convulsões crônicas não provocadas na epilepsia.
   2. Além disso, meça a duração da convulsão de cada convulsão observada, pois as mudanças na duração da convulsão estão relacionadas à gravidade da convulsão. Além disso, a latência para a primeira convulsão após a injeção de PTZ é outra medida importante a ser coletada. O monitoramento da frequência, duração e latência das convulsões é fundamental para qualquer estudo molecular pós-convulsão.
7. Injete PTZ a cada dois dias (Figura 1A). O número de injeções depende do objetivo do experimento. Os exemplos representativos são os seguintes.
   1. Para gerar animais completamente inflamados, uma vez que um animal sofra uma convulsão com uma pontuação de 5 (convulsão tônico-clônica), termine a injeção dentro de três administrações adicionais. Neste caso, aumente a dose da injeção se a pontuação de convulsão não aumentar durante três administrações consecutivas. Cada animal pode receber um número e dose diferentes de injeções de PTZ.
   2. Fixar o número e a dose de injeção de PTZ em todas as condições para avaliar a vulnerabilidade ao PTZ, inclusive em avaliações de medicamentos antiepilépticos e estudos do fenótipo de camundongos geneticamente modificados. Dê a todos os animais o mesmo número de injeções de PTZ; Recomenda-se um total de 8 a 12 injeções. Se um animal morrer, a pontuação de convulsão deve ser indicada como 6.
   3. Determine a dose de injeção necessária para manter uma pontuação alta de convulsão (4 ou 5) para 10 ou mais injeções para estudar as alterações histopatológicas que ocorrem nas crises epilépticas. Nesse caso, o número total de injeções deve variar de 25 a 30. Diminua a dose de injeção se a pontuação de convulsão atingir 5. Se a pontuação de convulsão diminuir para 3 ou menos, aumente a dose da injeção.

Resultados

Figura 1: Breve descrição do protocolo. (A) Ilustração esquemática de gravetos mediados por PTZ. (B) Ilustrações de comportamentos animais representativos para os respectivos escores de convulsão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pentilenotetrazol	Sigma-Aldrich	Pág. 6500
Cloreto de sódio	MANAC	7647-14-5
Rato	CLEA Japão		C57Bl/6NJcl, 8 semanas pós-natais, homens
Seringa (1mL)	Terumo	SS-01T
Agulha (27G x 3/4") (0,40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Balança de pesagem	Mettler	PE2000	Este item é um produto descontinuado. Quase equivalente ao FX-2000i com FXi-12-JA da empresa A&D.