Induzindo isquemia via oclusão do cérebro médio e da artéria carótida comum em um modelo de rato

Resumo

Fonte: Wayman, C. et al., Realizando Oclusão Cerebral Média Distal Permanente com Artéria Carótida Comum em Ratos Idosos para Estudar Isquemia Cortical com Incapacidade Sustentada. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento de realização da oclusão permanente da artéria cerebral média distal, ou MCAO, com a artéria carótida comum, ou ligadura CCA, em ratos idosos para modelar o AVC isquêmico. Isso bloqueia o fluxo sanguíneo para o cérebro, levando à morte neuronal e gerando um modelo para estudar os mecanismos do AVC e possíveis tratamentos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cirurgia

1. Utilizar ratas idosas com capuz de Lister aos 16-18 meses (250 a 400 g) e induzir anestesia com isoflurano a 5% em O₂. Após a indução da anestesia, reduza o nível de isoflurano e mantenha-o em uma profundidade adequada, mas minimizada, para a cirurgia (, por exemplo, , 1,5-2%). Aplique anestesia ao animal por meio de uma máscara facial e use um sistema de limpeza para limitar a exposição do cirurgião ao isoflurano.
   1. Realize todos os procedimentos até, mas não incluindo, craniotomia em animais simulados, pois esse procedimento pode produzir déficits comportamentais. Considere os objetivos experimentais ao projetar experimentos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) e decida se um grupo simulado para controlar a craniotomia deve ou não ser incluído.
2. Administre alívio da dor no pré ou perioperatório (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. corte).
   1. Adicione 1 ml a 19 ml de solução salina estéril a 0,9% para fazer a solução de estoque e injete 0,6 ml por 300 g de rato. O uso de Carprieve é preferível ao Carprofeno porque o primeiro é estável à temperatura ambiente (RT).
3. Raspe o pelo na região ventral do pescoço e a região temporal no hemisfério direito para expor a pele. Desinfete os locais cirúrgicos usando cotonetes de etanol.
   1. Execute esta etapa longe da área de operação para minimizar a quantidade de pelos no local da incisão.
4. Coloque o rato em um quadro de cortiça coberto com uma cortina estéril em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Aplique creme de lidocaína nas regiões raspadas da cabeça e pescoço. Insira uma sonda retal para monitorar e manter a temperatura do animal entre 36,5-37,5 °C com um sistema homeotérmico.
   1. Coloque pomada lacrilube nos olhos para evitar o ressecamento. Dê ao rato uma injeção de solução de sulfato de atropina (0,05 ml de uma solução de 600 μg/ml, por via subcutânea) para reduzir as secreções traqueais.
      NOTA: Os pesquisadores devem considerar a medição de variáveis fisiológicas, como gases sanguíneos e pressão.
5. Antes de iniciar a cirurgia, verifique a retirada da pinça da pata traseira e os reflexos de piscar para confirmar a anestesia completa.
6. Sob um microscópio de dissecação, faça uma incisão na linha média central de 2 cm no pescoço exposto usando um bisturi. Mova as glândulas salivares suavemente lateralmente à traqueia em ambos os lados.
7. Faça uma sutura de seda não absorvível ao redor da pele que cobre a artéria carótida comum de um lado. Afaste suavemente a pele do local usando a sutura de seda e cole-a no quadro de cortiça usando fita cirúrgica para revelar a artéria carótida comum. Disseque cuidadosamente as artérias livres da fáscia circundante e dos nervos vagais usando uma pinça fina.
   1. Tenha cuidado para não danificar os nervos musculares ou vagos durante esta etapa, pois isso prejudicará a alimentação, a deglutição e a respiração.
8. Uma vez exposta a artéria carótida comum, use uma sutura de seda não absorvível (5/0) para isolar a carótida, separando primeiro a carótida do nervo vago por dissecação reversa com pinças finas e tomando cuidado para não entrar em contato com o nervo. Uma vez que o vaso tenha sido enrolado (mas não amarrado) com a sutura, prenda as extremidades da sutura com fita cirúrgica para evitar que essa etapa seja desfeita. Remova as suturas que seguram a pele sobrejacente.
9. Repita para o outro lado.
10. Coloque uma gaze estéril embebida em solução salina na ferida para manter os tecidos úmidos durante o restante da cirurgia. Suture frouxamente a pele e coloque uma gaze adicional embebida em solução salina sobre a área para evitar mais desidratação.
11. Coloque os ratos em posição lateral e faça uma incisão na pele no ponto médio entre a órbita direita e o conduto auditivo externo. Retraia a pele usando até cinco afastadores elásticos de 3 mm presos ao quadro de cortiça e, em seguida, disseque o músculo temporal para revelar o crânio.
12. Coloque um gotejamento salino acionado por gravidade ajustado à roda do polegar acima do local aberto (vazão de aproximadamente 2 ml/min) e configure um sistema de aspiração para remover os detritos ósseos e limpar o sangramento menor do local exposto durante esta fase da cirurgia.
    1. Coloque o bico de aplicação de solução salina no ponto mais alto do crânio, perto da orelha, e o bico do aspirador no ponto mais baixo. Ajuste a roda durante os sangramentos para fornecer mais solução salina à área para visualizar melhor a origem de qualquer sangramento para cauterização do vaso, reduzindo a quantidade de tempo que os animais ficam sob anestesia.
13. Realize uma craniotomia na região exposta (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando uma broca odontológica com uma broca grossa revestida de diamante de 1,6 mm a aproximadamente 8.000 rpm, garantindo a aplicação de pressão circular e lateral e não pressão para baixo durante a perfuração da área exposta. Quando o osso estiver fino o suficiente para parecer completamente transparente, remova usando uma pinça.
14. Use um gancho dural caseiro, feito dobrando uma ponta de pinça fina aproximadamente 180° para formar um arco, para abrir cuidadosamente a dura-máter, tomando cuidado para evitar os grandes vasos sanguíneos superficiais, pois são delicados e fáceis de romper.
    NOTA: A área exposta do cérebro revelará a artéria cerebral média (MCA); o segmento desejado mede aproximadamente 2 mm de comprimento (consulte Figura 1).
15. Coagule a ACM de onde a veia cerebral inferior cruza, até o ponto de bifurcação da artéria e, em seguida, ao longo dos ramos caudais da ACM usando um par de pinças de diatermia até a oclusão total. Use pinça de diatermia de joalheiro angular com pontas pontiagudas de 0,25 mm.
    1. Ao ocluir a artéria, altere o fluxo salino conforme necessário para manter essa área fria, evitando que a pinça de coagulação adira ao vaso sanguíneo. Quando ocluído, o vaso sanguíneo parece preto e nenhum sinal de fluxo sanguíneo deve estar presente; O fluxo sanguíneo pode ser visto em vasos parcialmente ocluídos.
    2. Corte o MCA neste ponto para confirmar a oclusão completa. Usando uma tesoura microvascular, corte abaixo de onde a veia cerebral inferior cruza a ACM.
    3. Cubra a área exposta com uma gaze embebida em solução salina antes de continuar para a próxima etapa.
16. Vire o rato de volta para a posição supina e reabra a sutura frouxamente amarrada no pescoço para reexpor as artérias carótidas. Ligue a artéria carótida do mesmo lado que a ACM ocluída (direita) permanentemente, dando um nó na sutura de seda ao redor da carótida, enquanto a artéria carótida esquerda é ocluída transitoriamente usando um clipe de artéria de aço inoxidável de 13 mm com pressão de 125 g por 60 min. Suture frouxamente a incisão no pescoço durante esse período e coloque uma gaze estéril embebida em solução salina por cima para evitar a desidratação.
    1. Observe que o lado direito do animal estará no lado esquerdo do cirurgião, dado o posicionamento supino.

Resultados

Figura 1. Configuração cirúrgica do modelo de oclusão da artéria cerebral média distal permanente. O equipamento usado na configuração da craniotomia de rato é mostrado para o hemisfério direito e inserção, o posicionamento do aspirador e gotejamento salino ao redor do local da craniectomia. Também são mostradas as principais características da vasculatura; A artéria cerebral média (vermelho) e a ve...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Carprofeno	Norbrook	Vm nº; 02000/4229	dar 0,25 mg/kg
Sulfato de atropina	AmTech	RXATRINJ-100
Cotonetes com álcool	UHS	20021
Creme de lidocaína (Emla)	AstraZeneca	12901	Aplique uma gota do tamanho de uma ervilha no pescoço raspado e nas regiões temporais
Sistema de Cobertor Homeotérmico	Instrumentos de Harvard	507222F
Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11019-12
Isoflurano	Abbott	B506
Suturas de seda	Aparelho de Harvard	723288
Sistema de cauterização	Eschmann
0.25 mm Pinça de joalheiro	Eschmann	8330349
pinça Dumont fina	Ferramentas de Belas Ciências	11251-10
Sistema de gotejamento salino acionado por polegar
Sistema de aspiração Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
Fresas de aço revestidas com diamante grosso de 16 mm		K801 104 016
Broca odontológica portátil	NSK	NSKVMAXVRE (Peça de Mão NSKEX6B)
Tesoura de mola Vannas	Ferramentas de Belas Ciências	15000-03
Tesouras microvasculares	Instrumentos de Precisão Mundial	501790
4-0 Suturas de Vicryl	Ethicon
Clipe vascular e aplicador
Microscópio cirúrgico	Zeiss
Sistema de Anestesia Compacto Isoflurano K/F Gás Único	Soluções VetTech
Lâminas de bisturi de aço carbono nº 10	Swann-Morton	201
25g agulhas	Terumo	NN-2525R
Seringas (1 ml e 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Solução salina (cloreto de sódio 0,9%)	Fresenius Kabi	pl 08828/0178
Cotonetes	Johnson e Johnson	5.00021E+12	Esterilizar antes de usar
Gaze			Esterilizar antes de usar