Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparar a seringa para injeção
- Dissolva a lisolecitina em uma solução a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) e armazene a -20 ° C em pequenas alíquotas (75 μl). Descongele um frasco para injetáveis à temperatura ambiente (TR).
nota: Se a lisolecitina não estiver dissolvida, sonicar o tubo em um limpador ultrassônico (40 kHz) por aproximadamente 30 min para formar uma solução uniforme.
- Manuseie o capilar de vidro pré-puxado com extremo cuidado para evitar danificar a ponta delicada. Desaperte a porca de uma seringa injetora de 10 μl e rosqueie-a na extremidade plana do capilar, seguida por duas ponteiras, certificando-se de que as extremidades correspondentes das ponteiras se alinhem e o capilar esteja bem encaixado na ponteira cônica (Figura 1). Lave a seringa com álcool isopropílico e remova o êmbolo. Depois de seco, aperte o conjunto da agulha com a mão na seringa de injeção.
- Encaixe a agulha do cubo de metal na seringa de escorva. Perfure um disco de borracha com a agulha e deslize-o até a base. Encha a seringa de escorva com lisolecitina. Pressione suavemente a seringa de escorva até que o líquido fique visível na ponta da agulha. Isso garante que bolhas de ar não sejam introduzidas na seringa de injeção.
- Insira a agulha do cubo de metal da seringa de escorva na seringa de injeção. Fazendo uma vedação firme com o disco de borracha, pressione lentamente a seringa de escorva até que o capilar encha a ponta com a solução. Remova cuidadosamente a seringa de escorva enquanto pressiona simultaneamente para encher o cilindro da seringa de injeção sem introduzir bolhas de ar. Insira o êmbolo na seringa de injeção e certifique-se de que a solução flui da ponta do capilar enquanto o êmbolo é pressionado suavemente.
nota: Se forem visíveis bolhas de ar na seringa capilar ou injetora, a preparação da seringa deve ser repetida desde o início. O fluido contínuo no aparelho de injeção é fundamental para garantir volumes de injeção precisos.
- Encaixe a seringa de injeção completa no braço de um micromanipulador estereotáxico. Este aparelho completo será capaz de injetar de 15 a 20 animais antes de precisar ser reabastecido.
- Descarte a lisolecitina restante da seringa de escorva. Retire e pressione o álcool isopropílico várias vezes e retire a agulha do cubo de metal. Aguarde várias horas para que o álcool isopropílico restante na seringa de escorva evapore antes de encher novamente.
2. Prepare o animal para o procedimento cirúrgico
NOTA: Este procedimento é descrito para camundongos C57BL/6 fêmeas com idade entre 8 e 10 semanas.
- Anestesie o animal com uma injeção intraperitoneal de cetamina (200 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou de acordo com os regulamentos institucionais de cuidados com animais. Planeje que o animal fique sob anestesia por aproximadamente 1 hora se estiver usando anestesia injetável.
- Teste se o animal está profundamente anestesiado beliscando firmemente o pé. Um animal devidamente anestesiado não responderá ao beliscão.
- Usando uma tesoura, raspe uma área de 2-3 cm2 no lado dorsal do animal, perto das orelhas. Tenha cuidado para não danificar os ouvidos.
- Limpe a área com etanol 70% aplicado em uma gaze. Certifique-se de que todo o cabelo cortado foi removido da área. Desinfete a área com iodo.
- Aplique vaselina nos olhos para evitar o ressecamento durante todo o procedimento.
- Mantenha o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que esteja pronto para iniciar o procedimento.
3. Realize o procedimento cirúrgico
NOTA: Assegure a técnica asséptica adequada para todas as etapas do procedimento. Isso inclui o uso adequado de luvas, redes de cabelo, máscaras e cortinas. Todas as ferramentas devem ser esterilizadas antes de entrar em contato com o animal.
- Mova o animal para uma estrutura estereotáxica, com o lado dorsal para cima, elevado no meio por toalhas de papel dobradas para exagerar a curvatura da coluna. Prenda os braços e a cauda com fita cirúrgica e prenda a cabeça com uma pinça de dente. Barras auriculares estabilizadoras não são necessárias para este procedimento.
- Use um bisturi para fazer uma incisão na linha média de 3 cm, começando logo abaixo das orelhas e cortando na direção caudal.
- Localize a divisão entre as duas grandes estruturas adiposas e use uma pinça fina em cada mão para separá-las. Espalhe os afastadores para abrir o campo cirúrgico.
- Sob um microscópio cirúrgico, localize o processo de crescimento proeminente da vértebra torácica 2 (T2) (NOTA: Esta característica é característica da cepa de camundongo C57BL / 6). Realize uma dissecção romba com tesoura de mola fechada através da musculatura sobreposta para melhor visualizar T2. Usando a pinça, sinta as superfícies duras da vértebra torácica 3 (T3) e da vértebra torácica 4 (T4) para confirmar a localização anatômica adequada.
- Usando uma tesoura de mola, faça cortes laterais rasos (2-3 mm de profundidade) do tecido conjuntivo entre T3 e T4. Devido ao espaçamento natural entre as vértebras na porção torácica superior da coluna vertebral do camundongo, uma laminectomia é desnecessária para revelar a medula espinhal. Lembre-se de que um corte muito profundo perfurará e danificará o cordão.
nota: Um pequeno grau de sangramento é comum durante esta etapa. Se isso ocorrer, segure uma lança de esponja na área até que o sangramento diminua (30-60 seg).
- Visualize a medula espinhal. Ele será coberto com uma espessa camada de dura-máter visível se essa camada meníngea ainda não for cortada durante a exposição do cordão. Um vaso sanguíneo proeminente corre caudal/rostral através da linha média aproximada da medula espinhal.
nota: Essa vasculatura não deve ser usada como um ponto de referência para a linha média. Em vez disso, a iluminação adequada deve revelar os limites da substância cinza-branca que flanqueiam a coluna dorsal, que deve ser usada para estimar a linha média.
- Se a dura-máter permanecer intacta, faça raspagens laterais suaves com uma agulha de metal de 32 G até que esteja limpa. O objetivo é remover a dura-máter sem cortar as meninges subjacentes restantes, que não são tão grossas e mais difíceis de ver.
nota: A liberação do líquido cefalorraquidiano indica uma ruptura da aracnóide e, embora isso possa ocorrer sem danos mecânicos ao tecido, o líquido cefalorraquidiano acumulado deve ser removido com uma lança de esponja para visualizar melhor a superfície do cordão.
- Mova a seringa de injeção no lugar e abaixe-a lentamente até que a ponta do capilar toque a medula espinhal imediatamente lateral de cada lado da linha média. Trave o braço no lugar.
- Use as medições graduadas do braço estereotáxico da direção Z para fazer uma medição da posição da linha de base. Desta leitura, subtraia 1,3 mm. Use um movimento descendente rápido e superficial para perfurar o tecido e abaixe cuidadosamente o capilar até que a nova medição seja alcançada. Opcional: se desejado, as lesões na coluna dorsal podem ser produzidas pelo mesmo movimento de perfuração na linha média e uma profundidade de 0,3 mm.
nota: Esses valores são específicos para injeção entre T3 e T4. Se optar por realizar a injeção em qualquer outro local da medula espinhal, esses valores devem ser derivados de qualquer atlas cerebral de camundongo disponível.
- Use o micromanipulador para pressionar a lisolecitina na substância branca da medula espinhal ventral. Faça uma rotação do micromanipulador a cada 5 segundos por 2 min, resultando em um volume final de 0,5 μl. Deixe o capilar no lugar por mais 2 minutos para evitar o refluxo da solução e, em seguida, remova cuidadosamente o capilar.
- Amarre uma única sutura no músculo / tecido adiposo que cobre a coluna vertebral. Use uma sutura ininterrupta para fechar a pele. Aplique mais iodo no local da incisão.
- Coloque o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que ele se recupere e, em seguida, devolva-o à gaiola. Aplique analgésicos no pós-operatório de acordo com os regulamentos institucionais de cuidados com os animais. Cuidados pós-operatórios adicionais geralmente não são necessários, pois os animais são totalmente ambulatoriais e capazes de se alimentar e beber assim que se recuperam da anestesia.
- Repita o procedimento para os animais restantes.
nota: Com proficiência, a operação pode ser concluída em 10-15 minutos por animal, principalmente com a ajuda de uma segunda pessoa amarrando suturas. O mesmo capilar de vidro pode ser usado por aproximadamente 15 a 20 cirurgias antes que a ponta fique cega e deva ser substituída. As cirurgias de controle podem ser realizadas de forma idêntica à descrita, com uma injeção de PBS na medula espinhal em vez de lisolecitina. Não recomendamos a limpeza dos capilares para uso futuro.
