Induzindo lesão neuronal direcionada usando um laser de alta potência em uma larva de Drosophila

Resumo

Fonte: Li, D., Li, F., et al. Um modelo de lesão in vivo de Drosophila para estudar a neuroregeneração no sistema nervoso periférico e central. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um método para induzir lesão neuronal direcionada em larvas de Drosophila usando um laser de alta potência. Depois de posicionar a larva sob um microscópio, um laser de baixa potência procura neurônios fluorescentes e, em seguida, a potência do laser é aumentada para induzir danos localizados. A lesão é confirmada pelo aumento da fluorescência e uma cratera no local da lesão.

Protocolo

1. Lesão de dois fótons e imagem confocal

1. Configuração do microscópio
   NOTA: Um microscópio confocal de varredura a laser com um laser de dois fótons foi usado para este experimento, mas outros sistemas com uma configuração equivalente também serão suficientes. O laser de dois fótons (930 nm) foi usado para aplicar lesões e um laser de argônio (488 nm) foi usado para imagens confocais de GFP.
   1. No início de cada sessão, ligue o laser de dois fótons e/ou o(s) laser(s) confocal(is) e o microscópio. Em seguida, abra o software de imagem.
   2. Para lesão de dois fótons, configure os seguintes parâmetros para a imagem GFP com o laser de dois fótons a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selecione o modo de varredura de linha. Abra o orifício até o fim. Aumente a intensidade do laser para ~20% (390 mW).
      2. Selecione 512 x 512 como a varredura de quadros. Use a velocidade máxima de varredura (normalmente com o tempo de permanência do pixel em 0,77 μs). Certifique-se de que o número médio seja 1 e a profundidade de bits seja de 8 bits.
      3. Defina o ganho para ~750 e o deslocamento para 0.
      4. Salve este protocolo experimental predefinido como ablação 2P GFP 930, permitindo fácil reutilização em experimentos futuros.
   3. Para imagens confocais, configure os seguintes parâmetros para a imagem GFP com o laser de argônio a 488 nm:
      1. Selecione a guia Aquisição e, em seguida, pilha Z.
      2. Em "Laser", ligue a energia do laser de argônio de 488 nm.
      3. Vá para Canais, selecione o laser de 488 mm e aumente a potência do laser para 5-10%. Para o orifício, use a unidade 1-2 arejada (AU). Ajuste o ganho para 650.
      4. No Modo de aquisição, selecione 1024 x 1024 como a varredura de quadros, use a velocidade máxima de varredura, um número médio de 2 e profundidade de bits de 8 bits.
      5. Salve este protocolo experimental predefinido como GFP (proteína fluorescente verde) Imaging.
2. Anestesia de larvas com éter dietílico e montagem
   1. Numa hotte, colocar uma placa de vidro de 60 mm numa placa de Petri de plástico de 15 cm. Dobre e coloque um pedaço de papel de seda no fundo do prato de vidro e, em seguida, coloque um prato de ágar suco de uva sobre o lenço de papel. Adicione éter dietílico no prato de vidro, até o ponto em que o lenço de papel fique encharcado e haja uma camada de éter líquido remanescente no prato. Mantenha a tampa sempre aberta.
   2. Prepare uma lâmina de vidro com uma gota de óleo halocarbono 27 no centro. Adicione 4 pontos de graxa a vácuo nos quatro cantos da lâmina, para depois apoiar a lamínula.
   3. Use uma pinça para pegar uma larva limpa e coloque-a na placa de ágar no prato de vidro de 60 mm. Cubra o prato de vidro com a tampa e espere até que a larva pare de se mover. Para lesão / imagem do PNS, retire a larva assim que sua cauda parar de se contorcer. Para o SNC, espere até que toda a larva fique imóvel, especialmente os segmentos da cabeça.
      NOTA: O momento da exposição ao éter é crítico. Veja Discussão.
   4. Pegue cuidadosamente a larva anestesiada e coloque-a de cabeça erguida na gota de óleo de halocarbono na lâmina. Adicione uma lamínula na parte superior do slide. Use uma leve pressão para empurrar a lamínula para baixo, até que ela toque a larva (Figura 1A).
   5. Ajuste a posição da larva empurrando suavemente a lamínula para a esquerda ou direita para rolar a larva, de modo que o neurônio / axônio / dendrito de interesse fique na parte superior e mais próximo da lente do microscópio.
   6. Para lesão do SNP, monte o lado dorsal da larva para cima, de modo que ambas as traqueias fiquem visíveis. Em seguida, role a larva ~ 30 graus para a esquerda para ferir os axônios do neurônio da classe III (Figura 1B e 1C), 90 graus para ferir os axônios do neurônio da classe IV (Figura 1B e 1E) ou ~ 30 graus para ferir dendritos do neurônio da classe IV.
   7. Para lesão do SNC, posicione a larva com o lado perfeitamente ventral para cima, de modo que a região de interesse fique mais próxima da lente do microscópio no plano z.
3. Lesão por laser de dois fótons
   1. Coloque a lâmina com a larva sob o microscópio e prenda-a no lugar com o suporte da lâmina no palco. Use o objetivo 10X (0,3 NA) para encontrar a larva.
   2. Adicione 1 gota de óleo de objetiva na lamínula, mude para a objetiva 40X (1.3 NA) e ajuste o foco.
   3. Mude para o modo de varredura e reutilize o protocolo experimental 2P GFP 930 Ablation. Certifique-se de que o orifício esteja totalmente aberto.
      NOTA: A configuração precisa ser otimizada com base em sistemas individuais.
   4. Inicie o modo Ao vivo para localizar a região de interesse (ROI) e ajuste as configurações para obter uma boa qualidade de imagem com o zoom apropriado.
      NOTA: O objetivo desta etapa é encontrar o neurônio / axônio / dendrito para ferir, em vez de obter a imagem de melhor qualidade. Portanto, use as configurações mínimas suficientes para visualizar a área alvo, a fim de evitar superexposição ou fotobranqueamento.
   5. Parar a verificação em tempo real, para que o botão Cortar fique disponível. Deixe a imagem estática servir como roteiro. Selecione a função Cortar e ajuste a janela de varredura para focar no alvo a ser ferido.
   6. Reduza o ROI para ser o tamanho do local potencial da lesão. Por exemplo, basta cobrir a largura de um axônio ou dendrito, para garantir a precisão da lesão e reduzir os danos aos tecidos vizinhos. Se desejar, amplie o ROI antes de cortar, permitindo uma lesão mais precisa.
   7. Abra uma nova janela de imagem. Reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Determine o aumento na intensidade do laser com base no sinal de fluorescência do tecido escaneado no modo Live.
   8. Normalmente, defina a intensidade do laser de dois fótons a partir de 25% para lesão de SNP e 50-100% para lesão de VNC. Para lesão do axônio do SNP, certifique-se de que a intensidade do laser seja de ~480 mW e o tempo de permanência do pixel seja de 8,19 μs. Para a lesão do axônio VNC, certifique-se de que a intensidade do laser e o tempo de permanência do pixel sejam geralmente 965-1930 mW e 8.19-32.77 μs, respectivamente.
   9. Inicie a verificação contínua. Deixe o cursor sobre o botão Contínuo. Fique de olho na imagem e pare a varredura assim que for observado um aumento drástico na fluorescência.
      NOTA: O aparecimento do pico de fluorescência é devido à autofluorescência no local da lesão.
   10. Volte para o modo Ao vivo reutilizando as configurações. Encontre a região de interesse que acabou de ser segmentada ajustando o foco.
       NOTA: Uma boa indicação de lesão bem-sucedida é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão.
   11. Passe para o próximo neurônio e repita a partir da Etapa 1.3.5, para ferir vários neurônios em um único animal. Ou repita a Etapa 3.3.5 enquanto aumenta gradualmente a potência e/ou reduz a velocidade de varredura se a lesão inicial for insuficiente.
       NOTA: Caso a potência do laser seja muito alta, uma grande área danificada será visível na imagem de varredura ao vivo pós-lesão. Muitos ferimentos podem causar a morte da larva.
   12. Recupere a larva removendo cuidadosamente a lamínula e transferindo a larva lesionada para um novo prato com pasta de fermento. Cave várias cavernas na placa de ágar com fórceps; Como alternativa, faça uma ilha de ágar no prato em vez de usar o prato inteiro, para reduzir a possibilidade de a larva rastejar para fora do prato.
   13. Coloque a placa em uma placa de Petri de 60 mm com tecido úmido (embebido em solução de ácido propiônico a 0,5%) e cultive em temperatura ambiente ou 25 ° C.
       NOTA: A larva permanecerá no estágio larval por aproximadamente um dia extra à temperatura ambiente (22 ° C) em comparação com 25 ° C.

Resultados

Figura 1: A regeneração do axônio do neurônio Da na periferia exibe especificidade de classe. (A e B) Desenho esquemático mostrando a posição das larvas. (C) Desenho esquemático dos neurônios da classe III. (D) Axônios dos neurônios da classe III ddaF, marcados com 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, não voltam a crescer. (E) Desenho esquemático dos neurônios da classe IV. (F) Axônios dos ne...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Éter dietílico, reagente ACS, anidro	Acros Organics	AC615080010
Óleo Halocarbon 27	Genesee Scientific	59-133
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), concentrado 20x, pH 7,5, fornecedor # E703-1L	VWR	97062-948
Ágar em pó, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Suco de uva	Welch's
Etanol 95% (Álcool Reagente 95%)	VWR	64-17-5
Ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283
Ácido propiônico	J.T.Baker	U33007
Óculos de capa: Retângulos	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 880	Zeiss
Software Zen	Zeiss
Camaleão Ultra II	Coerente