1. Preparação de meios e reagentes
- Descongele o revestimento da matriz da membrana basal para placas de cultura a 4 °C (não permita que a matriz da membrana basal aqueça, ou ela solidificará). Faça alíquotas de 1 mL e armazene-as a -20 °C ou -70 °C.
- Reconstitua o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) a 10 μg/mL e faça alíquotas de 10 μL. Armazene-os a 4 °C.
- Em um frasco novo e fechado de 500 mL de DMEM/F12 com glutamina, adicione B27 (10 mL), N2 (5 mL) e penicilina-estreptomicina (5 mL). Coloque 50 mL deste meio de células-tronco neurais (NSC) em um tubo cônico e adicione 10 μL de 10 μg / μL (2 μg / mL final) bFGF. Armazene o meio NSC (+) bFGF a 4 °C.
- Para fazer mídia (-) bFGF, use a mesma receita descrita na etapa 1.3, mas não adicione bFGF. Este meio será usado para diferenciar NSCs em neurônios e para manter culturas neuronais após a diferenciação.
2. Construtos Lentivirais
NOTA: Antes de começar a trabalhar com construções lentivirais, certifique-se de que o laboratório tenha sido aprovado para usar agentes de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Além disso, capuzes de cultura BSL-2, equipamentos de proteção individual (EPI) e métodos de descarte devem ser usados ao trabalhar com vetores lentivirais.
- Obtenha construções tau empacotadas em lentivírus de uma fonte preferida.
3. Cultura de células-tronco neurais humanas
NOTA: Os NSCs são normalmente semeados em 100.000–150.000 células/cm2 e a maioria dos NSCs disponíveis comercialmente são vendidos como 1 x 106 células/frasco. Este protocolo foi otimizado para placas de cultura de células de 10 cm (embora outros tamanhos de placas possam ser usados); portanto, se NSCs disponíveis comercialmente estiverem sendo usados, os NSCs podem precisar ser expandidos sendo primeiro cultivados em placas de seis poços para resultar em células suficientes para semear placas de 10 cm. Este protocolo pode, alternativamente, ser adaptado para uma variedade de tamanhos de placas de cultura de células.
- Para a preparação de placas de cultura de células, remover uma alíquota de revestimento de matriz de membrana basal congelada para placas de cultura de células e deixá-la descongelar a 4 °C (as alíquotas podem ser colocadas a 4 °C durante a noite no dia anterior à semeadura das células). Adicionar 385 μL de revestimento de matriz de membrana basal a 5 mL de meio DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina.
NOTA: 5 mL de meio DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina são suficientes para revestir uma única placa de 10 cm (1 mL desta solução de revestimento de matriz de membrana basal é suficiente para revestir um poço de uma placa de seis poços). Alternativamente, se as células forem fixadas e imunomarcadas, ou coradas para tioflavina, células de cultura em lamínulas de vidro em placas de cultura de 24 poços.
- Mantenha a mídia e o revestimento da matriz frios antes e enquanto os adiciona às placas de cultura. Adicione o revestimento da matriz da membrana basal às placas de cultura e coloque as placas em uma incubadora (a 37 ° C) por 1 h. Para um revestimento ideal, não incube a matriz da membrana basal por mais ou menos de 1 h. Após 1 h, aspire o revestimento da matriz da membrana basal das placas de culturas de células. Certifique-se de que isso coincida com o NSCs estar pronto para ser revestido.
nota: Se as células não estiverem sendo descongeladas de estoques congelados, pule a etapa 3.2 e continue com a etapa 3.3.
- Se as células estiverem sendo descongeladas de estoques NSC congelados, pegue um frasco de células congeladas e aqueça-o em banho-maria aquecido a 37 ° C, movendo o frasco para frente e para trás na água. Depois de descongelado, borrife o frasco com etanol a 70% e coloque-o em uma capa de cultura de células. Transfira as células para ~ 10 mL de meio DMEM / F12 + penicilina-estreptomicina e centrifugue o tubo em temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min. Aspire o meio e ressuspenda as células no meio NSC.
- Diluir as células em meio NSC para obter a densidade de semeadura apropriada para o vaso de cultura celular que está sendo usado.
nota: Por exemplo, se os NSCs estão sendo plaqueados em uma placa de seis poços - um poço em uma placa de cultura de seis poços tem uma área de superfície de 9 cm2 - 900.000 a 1.350.000 células são necessárias para semear. Assim, um frasco contendo 1.000.000 de células pode ser ressuspenso em 2 mL de meio e adicionado a um único poço de um prato de seis poços.
- Adicione células suficientes suspensas em meio NSC para semear as placas de cultura revestidas com matriz da membrana basal (100.000 células/cm2) e troque o meio a cada dois dias (se estiver usando um estoque congelado, troque o meio no dia seguinte ao plaqueamento e a cada dois dias a partir de então). Cultive as células até que estejam 75% a 80% confluentes.
nota: As células provavelmente atingirão 75% a 80% de confluência logo após o reforço, mas isso pode levar mais tempo se forem usados estoques congelados.
- Uma vez que os NSCs sejam 75% a 80% confluentes, comece a diferenciação neuronal removendo o meio NSC (+) bFGF e substituindo-o pelo meio NSC (-) bFGF. Cultive as células neste meio (substituindo o meio em dias alternados) por pelo menos 4 semanas.
nota: As células continuarão a se dividir por alguns dias após a retirada do bFGF; portanto, as células podem atingir 90–100% de confluência.
- Após a cultura por 4 semanas, as células terão alcançado um destino neuronal e estarão prontas para o tratamento do lentivírus.
4. Transdução e Manutenção de Culturas Neuronais
- Para transduzir neurônios com lentivírus, use uma contagem de títulos de 3,4 x 105 unidades transdutíveis/célula (uma antena 100% confluente de 10 cm conterá ~ 10 milhões de neurônios). Diluir as unidades transdutíveis até à concentração necessária nos meios de cultura de células e adicioná-las às células (utilizar o volume normal de meios para a placa de cultura de células). Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células 1x com meio fresco de (-) bFGF (sem lentivírus) e continue a cultura em meio (-) bFGF como de costume.
- Para o tratamento pós-lentiviral, alimente os neurônios transduzidos trocando o meio de cultura celular ([-] bFGF media) a cada dois dias. Mantenha as células por ~ 8 semanas após a transdução. Visualize rotineiramente as células sob um microscópio óptico para garantir a viabilidade.
nota: Esparsidade ou quebras dendríticas são sinais de que as células não são mais viáveis.
