Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Preparativos
- Modifique um cateter de veia periférica de 16 G para intubação. Para modificar, encurte a agulha em 1 cm e dobre o restante distal 1 cm em 30° em direção à válvula de injeção. Remova as asas do cateter (uso múltiplo).
- Para fazer uma sonda de pressão intracraniana ou PIC, corte um pedaço de tubo de polietileno de 20 mm (diâmetro interno (ID): 0,58 mm, diâmetro externo (OD): 0,96 mm) e queime uma extremidade para fazer uma placa circular, mantendo um lúmen aberto. Circunde o tubo de polietileno com 1 mm de tubo de silicone (ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm) antes de conectar 10 mm de tubo de silicone (ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm) à extremidade do tubo de polietileno.
- Ligue o laptop e abra o software de aquisição de dados. Calibre os transdutores de pressão arterial (PA) e pressão intracerebral (PIC) e o Laser-Doppler de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare o aparelho analisador de gases sanguíneos.
CUIDADO: Certifique-se de que haja isoflurano suficiente no vaporizador.
- Ligue o O2 e o fluxo de ar atmosférico. Defina o fluxo de O2 em 30% e o ar atmosférico em 70%.
- Coloque a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 37 °C.
2. Anestesia
- Coloque o rato na câmara de anestesia com um fluxo de 30% de O2 e 70% de ar atmosférico. Administrar 5% de gás isoflurano na câmara. A anestesia adequada levará cerca de 4 min. Controle a respiração com cuidado.
- Quando anestesiado, coloque o rato em decúbito dorsal em uma placa pesada contornada por um elástico. Coloque os dentes da frente do rato abaixo do elástico.
- Puxe a língua para fora cuidadosamente com uma pinça curva. Limpe a laringe com uma ponta de algodão. Coloque uma luz externa na linha média da garganta para visualizar as cordas vocais.
- Intubar durante a inspiração usando o cateter de veia periférica 16 G modificado. Quando inserido corretamente, remova o estilete. Conecte o cateter ao ventilador.
NOTA: O posicionamento correto do tubo é confirmado pelos movimentos do tórax em sincronia com a frequência respiratória. Se forem observados movimentos do abdômen, extube e reintroduza o rato no sino de anestesia. Não repita o procedimento mais de três vezes devido ao risco de danificar as vias aéreas.
- Quando intubado, mantenha o animal em respiração artificial com 30% de O2 } e 70% de ar atmosférico. Mantenha a anestesia a 1,5%-3% de isoflurano. Ajuste o isoflurano para manter a pressão arterial entre 80-100 mmHg.
- Mantenha o volume inspiratório do respirador em 3 mL e a frequência em 40-45 inspirações/min. Ajuste o volume inspiratório de acordo com a gasometria.
- Faça um ponto no tecido mole interno da bochecha com uma sutura 2-0. Amarre a sutura ao redor do tubo de injeção e da válvula de injeção do cateter de veia periférica para prender o cateter.
- Mova o rato para o campo cirúrgico e coloque-o em decúbito dorsal com a cauda voltada para o cirurgião.
- Aplique o gel para os olhos quando necessário para combater os olhos secos.
- Faça uma pinça no dedo do pé para confirmar uma profundidade adequada de anestesia. Avalie e mantenha a profundidade da anestesia durante a cirurgia.
3. Cateter de cauda
- Desinfete os 3-4 cm proximais da cauda com 0,5% de etanol de clorexidina.
NOTA: A partir de agora, use o microscópio cirúrgico a critério do cirurgião.
- Faça uma incisão na pele de 15-20 mm na extremidade proximal da cauda no lado ventral. Tenha cuidado para não incisar a artéria.
- Afrouxe a pele do tecido conjuntivo subjacente usando uma pinça curva.
- Penetre cuidadosamente na fáscia expondo a artéria.
- Solte cuidadosamente a artéria da cauda do tecido subjacente usando uma pinça curva.
- Deslize três fios de seda preta sob o recipiente. Coloque um fio o mais distalmente possível e dê um nó cirúrgico firmemente ao redor da artéria. Segure as pontas soltas do fio com um hemostático.
- Amarre os dois fios restantes frouxamente ao redor da artéria.
- Empurre o fio proximal o mais proximalmente possível. Aplique um hemostático para segurar as extremidades da rosca proximal. Puxe o hemostático levemente, mas o suficiente para restringir e bloquear o fluxo sanguíneo. Coloque o hemostático no abdômen.
- Corte a ponta do cateter em um ângulo de 45°. Corte a ponta afiada para evitar a penetração da parede arterial.
- Usando uma tesoura Vannas, faça uma incisão na artéria 1/3 do diâmetro da artéria em um ângulo de 30°, a 3-5 mm do nó distal.
- Insira o cateter na artéria usando duas pinças retas. Use uma pinça para segurar o cateter e a outra para puxar cuidadosamente a artéria sobre o cateter.
- Insira o cateter até o vaso até o nó proximal e solte o nó do hemostático. Visualize o fluxo sanguíneo no cateter. Prenda a rosca do meio frouxamente ao cateter.
- Continue a inserção e, se possível, logo além do ponto em que a artéria é coberta novamente pela fáscia.
- Controle a colocação do cateter e possível vazamento lavando com solução salina.
- Prenda os dois fios proximais usando nós cirúrgicos.
NOTA: A medição da pressão arterial precisa ser pulsátil; caso contrário, o cateter não está colocado corretamente.
- Prenda o cateter no final da incisão dando um nó cirúrgico usando o fio distal.
- Costure a incisão da pele frouxamente com duas suturas monofilamentares 4-0 não reabsorvíveis. Tenha cuidado para não penetrar no cateter.
NOTA: Durante toda a cirurgia, esteja ciente da amplitude da pulsação. Se estiver baixo, lave o cateter com solução salina.
- Afrouxe o cateter arterial do transdutor de pressão para permitir o fluxo sanguíneo para amostragem de gases sanguíneos. Coloque um tubo microcapilar na extremidade do cateter. Deixe o sangue fluir para o tubo. Reconecte o cateter ao transdutor após a coleta de sangue e lave o cateter.
- Insira o tubo capilar no analisador de gases sanguíneos. Meça o pH, pCO2 e pO2 e anote-os
NOTA: Dependendo dos valores de gasometria e pressão arterial, altere a taxa de ventilação. Se a pressão arterial média (PAM) estiver muito baixa, tente diminuir a vazão de isoflurano. Teste os reflexos para garantir a profundidade adequada da anestesia.
4. Sonda ICP
- Coloque o rato no quadro estereotáxico. É importante posicionar o rato simetricamente.
- Coloque um travesseiro cilíndrico sob a estrutura estereotáxica para criar flexão anterior do pescoço.
- Raspe o couro cabeludo, o pescoço e a área atrás das orelhas do rato. Remova o cabelo supérfluo.
- Desinfetar a área com 0,5% de etanol de clorexidina.
- Anestesiar localmente com 0,7 mL de lidocaína 10 mg / 5 μg / mL com adrenalina, inserir a agulha na extremidade caudal do crânio na linha média. Injete na musculatura do pescoço com 0,3-0,4 mL. Injete o restante por via subcutânea ao redor e anterior ao bregma.
- Faça uma incisão na pele a partir da punção da agulha ~ 8 mm caudalmente na linha média.
- Disseque todos os músculos sem rodeios em camadas para identificar a membrana atlantooccipital (triângulo cor de mármore caudalmente ao crânio na linha média).
- Use o afastador Alm para conter a musculatura do pescoço. Coloque o afastador com pino caudalmente, se necessário.
- Verifique se a sonda ICP estéril está conectada ao transdutor ICP. Lave a sonda ICP com solução salina. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na sonda ICP.
- Incisar a membrana atlantooccipital com uma agulha de 23 G. Faça um orifício para persuadir a sonda ICP através da membrana.
- Persuadir a sonda através da membrana atlantooccipital suavemente. Puxe a sonda levemente e certifique-se de que ela mostre uma curva pulsante variando entre 0-5 mmHg. Caso contrário, remova a sonda, verifique a conexão com o transdutor e confirme o fluxo através do lúmen.
- Aplique duas gotas da cola de tecido. Mova o tubo de silicone de 1 mm para a frente para a membrana e aplique cola adicional para minimizar o risco de deslocamento da sonda ICP.
- Remova o(s) retrator(es).
- Faça uma sutura horizontal em colchão na extremidade cefálica da incisão e uma sutura simples interrompida na extremidade caudal usando uma sutura monofilamentar 4-0 não reabsorvível.
5. Colocação da agulha e da sonda Laser-Doppler
- Faça uma incisão na linha média logo anterior aos olhos, 15 mm caudalmente.
- Remova o tecido conjuntivo e os músculos com uma pinça. Use a ponta de um cotonete estéril como rougine, permitindo identificar o bregma e as suturas coronais.
- Coloque o afastador Alm.
- Colocar uma agulha espinhal de 25 G na estrutura estereotáxica. Coloque a agulha exatamente no bregma e observe a posição.
NOTA: Coloque a articulação da linha média do quadro estereotáxico a 30° em direção ao animal no plano vertical.
- Remova a agulha do bregma, mova a armação 65 mm anteriormente e, em seguida, recoloque a agulha na linha média para marcar o local da perfuração.
- Perfure até que a dura-máter seja identificada abaixo do osso. Remova suavemente os fragmentos ósseos usando uma pinça reta e preencha a cavidade com cera óssea.
- Faça outro orifício 3-4 mm lateral à direita do bregma e logo anterior à sutura coronal para o Laser-Doppler. Não é necessário perfurar todo o osso. Tenha cuidado para não penetrar na dura-máter.
- Procure os vasos onde o laser-doppler pode medir o fluxo sanguíneo. Coloque o laser-doppler e verifique os valores. É necessário um valor mínimo de 100 FU. Remova o microscópio (luz artificial).
- Se os valores ainda forem aceitáveis, adicione uma gota de cola para fixar a sonda.
- Verifique novamente para confirmar se o valor está acima de 80 FU. Se o valor estiver abaixo de 80 FU, remova e reposicione a sonda para atingir um valor acima de 80 FU.
NOTA: O valor, FU, é uma unidade arbitrária que mostra o fluxo sanguíneo cerebral (CBF).
6. Indução de hemorragia subaracnóidea (HAS)
- Insira a agulha suavemente através do crânio na linha média entre os hemisférios até sentir a resistência da base do crânio. Retraia a agulha em 1 mm para garantir o posicionamento correto logo antes do quiasma óptico.
- Gire a agulha 90° no sentido horário para que a ponta da agulha aponte para a direita para garantir o resultado mais homogêneo ao injetar o sangue. Remova o estilete (Figura 1).
- Equilibre por 15 min e ajuste o nível de anestesia para obter uma pressão arterial média na faixa de 80-100 mmHg.
- Faça uma análise de gases sanguíneos. Ajuste o nível de anestesia de acordo.
- Retire 500 μL de sangue do cateter de cauda usando uma seringa de 1 mL com uma agulha romba de 23 G.
- Preencha o espaço morto da câmara da agulha espinhal com sangue para evitar a injeção de ar. Remova a agulha de 23 G da seringa cheia de sangue e confirme se a seringa contém 300 μL de sangue.
- Conecte a seringa à agulha espinhal. Segure com firmeza e injete o sangue manualmente para superar o MAP.
- Observe um aumento acentuado no ICP e uma queda acentuada no CBF no laptop.
NOTA: O FSC deve ser de 50% ou menos em comparação com a pontuação inicial por pelo menos 5 min para que a cirurgia seja bem-sucedida, consulte Figura 2. Ratos simulados não passam pelas etapas 6.1-6.7, omitindo assim a introdução da agulha espinhal no cérebro, minimizando possíveis hemorragias espontâneas e danos cerebrais iatrogênicos.
