Medição de Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Neurônios usando Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Liang, K. X., et al. Análise por citometria de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a marcação de células neuronais com anticorpos para complexos da cadeia respiratória mitocondrial, proteína associada ao DNA mitocondrial e proteína da membrana externa mitocondrial, seguida de citometria de fluxo para quantificar seus níveis.

Protocolo

1. Medição por citometria de fluxo de subunidades complexas MRC (cadeia respiratória mitocondrial) e TFAM (fator de transcrição mitocondrial A) em células fixas

1. No final do período de cultura, separar as células (~10⁶) adicionando o reagente de dissociação celular; em seguida, granular e recolher as células num tubo de 15 ml. Lave as células por centrifugação com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x) duas vezes centrifugando a 300 × g por 5 min.
2. Fixe as células em paraformaldeído (PFA) a 1,6% (1 mL de PFA a 1,6% em um tubo de 15 mL) à temperatura ambiente (RT) por 10 min. Lave as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes centrifugando a 300 × g por 5 min.
3. Permeabilize as células com metanol a 90% gelado (1 mL de metanol a 90% em um tubo de 15 mL) a -20 °C por 20 min.
4. Bloquear as amostras em tampão de bloqueio contendo glicina 0,3 M, soro de cabra a 5% e albumina de soro bovino (BSA) a 1% - Fração V em PBS (1x) (1 mL de tampão de bloqueio em tubo de 15 mL). Lave as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes.
5. Incube as células com os seguintes anticorpos primários por 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para medição da subunidade do complexo I, anti-succinato desidrogenase complexo flavoproteína subunidade A (SDHA, 1:1.000) para medição da subunidade do complexo II e anti-COX IV (1:1.000) para medição da subunidade do complexo IV e anticorpo anti-TFAM (fator de transcrição mitocondrial A) conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400). Aplique a coloração do mesmo número de células separadamente com anticorpo anti-TOMM20 (translocase da membrana mitocondrial externa 20) conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400) por 30 min (1 mL de solução de anticorpo primário em um tubo de 15 mL; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os anticorpos).
6. Lave as células com PBS (1x) uma vez com centrifugação a 300 × g por 5 min. Adicione anticorpo secundário (1:400) em tubos de NDUFB10, SDHA e COX IV e incube as células com essas soluções por 30 min.
7. Lave as células com PBS (1x) uma vez, centrifugando a 300 × g durante 5 min. Aspire os sobrenadantes, deixando cerca de 100 μL nos tubos. Ressuspenda os grânulos celulares em 300 μL de PBS (1x). Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL mantidos no escuro no gelo.
8. Analise as células no citômetro de fluxo (com uma configuração de laser 3 azuis e 1 vermelho). Detecte sinais no filtro 1 (FL1) usando um filtro passa-banda 530/30.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Anticorpo Primário; use como 1:400, 2,5 μL em solução de coloração de 1000 μL; use IgG2b Alexa Fluor® 488 monoclonal de camundongo como controle de isotipo.
anti-TOMM20 conjugado com Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotecnologia	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Anticorpo Primário; use como 1:400, 2,5 μL em solução de coloração de 1000 μL; use IgG2a Alexa Fluor® 488 monoclonal de camundongo como controle de isotipo.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μL em solução de coloração de 1000 μL; use Alexa Fluor ® 488 cabra anti-coelho IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μL em solução de coloração de 1000 μL; use Alexa Fluor ® 488 cabra anti-coelho IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 μL em solução de coloração de 1000 μL; use Alexa Fluor ® 488 cabra anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11001) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de camundongo como controle de isotipo.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Usado para etapas de lavagem
Formaldeído (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fixação celular
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Usado no buffer de bloqueio
Albumina de Soro Bovino	Europa Bioprodutos	EQBAH62-1000	Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunocoloração e ingrediente CDM