Ensaio de luciferase para medir a atividade da γ-secretase em células humanas

Resumo

Fonte: Wang, B., et al., Medição quantitativa da proteína precursora de amilóide mediada por γ-secretase e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio repórter de luciferase baseadas em células. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento de medição da atividade da γ-secretase em células humanas geneticamente modificadas usando um sistema induzível por tetraciclina. O processo envolve a indução da expressão do gene APP com tetraciclina, geração de peptídeos β amilóide e ativação da produção de luciferase. A bioluminescência resultante da reação luciferase-substrato é então medida, refletindo a atividade da γ-secretase.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Medição dos sinais repórter da luciferase, que correspondem à clivagem da γ-secretase de APP-C99 ( proteína precursora de amilóide - fragmento de 99 aminoácidos C-terminal)

NOTA: Consulte as publicações anteriores para obter descrições detalhadas da geração de células CG (C99-Gal4).

1. Semear células CG (20.000 células/poço) em microplacas de 96 poços com um volume final de 200 μL/poço em meio de crescimento composto pelo meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) mais 10% de soro fetal bovino (FBS), 5 μg/mL de blasticidina, 250 μg/mL de antibiótico (, por exemplo, , zeocina), e 200 μg/mL de higromicina B.
   1. Conte as células com um hemocitômetro.
   2. Transferir as microplacas para uma incubadora de CO₂ humidificada e incubar a 37 °C durante a noite.
2. Remova 100 μL de meio de crescimento de cada poço.
3. Adicionar 100 μL/alvéolo de meio de crescimento contendo 2 μg/ml de tetraciclina com 0,2% de dimetilsulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butiléster (DAPT) ou outros inibidores de ErbB1/ErbB2 relacionados.
4. Incubar células CG tratadas em microplacas a 37 °C durante 24 h.
5. Remova 150 μL/meio de crescimento de poço das microplacas.
6. Adicione 50 μL/poço de reagente de ensaio de luciferase (consulte Tabela de Materiais).
7. Transfira as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência.
   1. Mantenha as microplacas em temperatura ambiente por 5 min com agitação suave.
8. Determine a luminescência emitida pela lúcifera (FL) } Firefly usando um programa predefinido armazenado no leitor de microplacas de luminescência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Leitor de placas de luminescência VictorLight	PerkinElmer	2030-0010
Classe II, Tipo 2 Gabinete de Segurança Biológica	Thermo Scientific	1300 Série A2
CL-387.785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	Merck	565770
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher	12100046	Componente principal do meio de crescimento
Soro fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher	16000044
Blasticidina	Thermo Fisher	A1113903
Zeocina	Thermo Fisher	R25005
Higromicina B	Gibco	10687010
Hemocitômero	Sigma-Aldrich	BR717805 Aldrich
Microplaca de 96 poços	Nunc	156545
Tetraciclina	Sigma	T7660
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Reagente de ensaio de luciferase Steady-Glo	Promega	E2510
Incubadora de CO2 umidificado	Revco	Ultima II
Linha celular T-REx293	Invitrogen	R71007
Software Wallac 1420 versão 3.0	PerkinElmer		Software de controle do instrumento do leitor de microplacas de luminescência