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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Fatiamento do cérebro
- Imobilizar e anestesiar camundongos pela aplicação de isoflurano a 3%.
- Mergulhe uma bola de algodão com gotas de isoflurano e coloque-a em um tubo de microcentrífuga de 15 mL. Coloque o nariz do animal no tubo e deixe-o inalar o isoflurano. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.
- Coloque o animal de costas e imobilize-o prendendo suas extremidades com um pino em T enquanto tem acesso ao abdômen.
- Corte o animal com uma tesoura cirúrgica, cortando a pele abdominal e cortando a pele na região do tórax. Prenda a pele usando pinos em T. Em seguida, quebre a membrana peritoneal até o tórax. Exponha o coração rachando a cavidade torácica e cortando o diafragma.
- Corte o átrio direito para permitir que o sangue flua para fora do animal. Insira uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 25 no ventrículo esquerdo e perfunda com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
nota: Isso permite que a solução flua pela circulação sistêmica e saia pelo átrio direito.
- Remova a seringa de 10 mL e insira uma agulha de calibre 25 conectada à seringa de 60 mL. Perfundir através do ventrículo esquerdo com 50 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) gelado.
- Prepare a solução gelada de PFA a 4% diluindo a solução de PFA a 10% em H2O e resfriando a solução final de PFA a 4% a 4 °C.
- Isole a cabeça do rato e remova o cérebro do crânio.
- Corte a pele do pescoço e, em seguida, corte em direção aos olhos para expor o crânio. Quebre o crânio do pescoço ao nariz e depois de um globo ocular ao outro. Descasque o crânio e excise todo o cérebro.
- Incubar o cérebro em PFA a 4% durante 24 h a 4 °C.
- Transfira o cérebro com fórceps para um tubo cônico de 50 mL cheio de 25 mL de solução de sacarose a 30%. Mantenha-o a 4 ° C por 48-72 horas até que o cérebro afunde no fundo do tubo.
- Corte o cérebro com uma matriz de corte de cérebro de camundongo adulto coronal através do mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Mantenha a seção do cérebro contendo o tronco cerebral.
nota: Isso resultará em duas seções cerebrais - uma contendo a maior parte do córtex (anterior do corte) e outra contendo o tronco encefálico / cerebelo (posterior do corte). Use a seção do tronco encefálico para as etapas a seguir.
- Incorpore a seção do tronco cerebral com a superfície de corte colocada na parte inferior de um molde de incorporação, cercada por um composto de temperatura de corte ideal (OCT); mova o cérebro embutido para um freezer de -80 ° C e congele por pelo menos 12 h - até uso posterior.
- Corte no criostato: colocar o molde de incorporação contendo o cérebro em OCT no criostato; incubá-lo no criostato durante várias horas para ajustar a temperatura do bloco cerebral à do criostato.
- Retire o molde de incorporação para expor o bloco OCT que contém o cérebro.
- Use lâminas de barbear para remover o excesso de OCT da superfície do bloco sem tocar no cérebro.
- Monte o bloco OCT no mandril do criostato, expondo a superfície de corte do cérebro para a frente.
- Ajuste a superfície de corte do cérebro para que fique orientada paralelamente às lâminas de barbear do criostato.
- Apare o cérebro começando pela medula, cortando seções de 100 μm rostalmente.
- Apare rostralmente até que o cerebelo e o tronco encefálico sejam cortados como uma fatia contínua. Comece a coletar fatias com 50 μm de espessura.
nota: À medida que se apara rostralmente da medula, o tronco encefálico e o cerebelo serão cortados como duas seções separadas. Nas seções rostrais, o tronco encefálico e o cerebelo acabarão se fundindo ao nível do 4º ventrículo. Uma vez que as bordas laterais do 4º ventrículo estejam bem formadas, o cerebelo e o tronco encefálico sairão como uma fatia contínua.
- Colete uma fatia de cérebro cercada por OCT com uma pinça e coloque-a em um poço de uma placa de 24 poços cheia de PBS (Figura 1a). O locus coeruleus (LC) será mais proeminente quando o cerebelo e o colículo inferior se encontrarem a ~-5,52 mm posterior do bregma (Figura 2b).
nota: A parte mais anterior da CL desaparecerá quando o cerebelo tiver sido totalmente seccionado e não envolver mais o colículo inferior a ~-5,34 mm posterior do bregma (Figura 2c).
2. Imuno-histoquímica para dopamina β-hidroxilase (DBH) ou tirosina hidroxilase (TH) (Figura 1)
- Dia 1
- Lave as fatias selecionadas três vezes por 5 min em PBS.
- Permeabilize por 24 h em solução salina tamponada com fosfato a 0,5% com detergente (PBSD) a 4 ° C.
- Diluir 125 μL de detergente em 25 mL de PBS.
- Dia 2
- Lave as fatias três vezes por 5 minutos em PBSD a 0,5%.
- Adicionar o anticorpo primário, anti-DAP ou anti-TH, durante 18 h a uma diluição de 1:500 em PBSD a 0,5% a 4 °C.
- Dia 3
- Lave as fatias três vezes por 10 min em PBSD a 0,5%.
- Adicione o anticorpo secundário desejado (488 burro anti-coelho para fluorescência verde) a uma diluição de 1:1000 em PBSD a 0,5% por 16 h.
- Embrulhe a placa de 24 poços em alumínio e coloque a 4 °C.
- Lave as fatias três vezes por 5 minutos em PBSD a 0,5%.
- Lave por 5 min em PBS.
- Transfira as fatias com um pincel para um recipiente de água.
- Monte fatias flutuando na água em lâminas carregadas.
- Seções de lamínula com meio de montagem rígido Dopamina beta-hidroxilase
- Seque as seções cerebrais montadas por 30 min em temperatura ambiente.
- Fatias cerebrais de imagem em um microscópio confocal ou fluorescente com configurações para detectar sinais do comprimento de onda de fluoróforo de anticorpo secundário apropriado.
- Ajuste o microscópio ao plano focal da fatia do cérebro e tire uma única imagem com ampliação de 10X.
