Um método para infligir traumatismo cranioencefálico fechado na cabeça em Drosophila

Neste artigo

Resumo

Fonte: Katzenberger, R. J., et al., Um método para infligir traumatismo cranioencefálico na cabeça fechada em Drosophila. J. Vis. Exp. (2015).

O vídeo demonstra o uso de um dispositivo de trauma de alto impacto (HIT) para induzir traumatismo cranioencefálico (TCE) de cabeça fechada em Drosophila. O TCE causa trauma cerebral mecânico que afeta a função neuronal, o que, com o tempo, leva à neurodegeneração e mortalidade.

Protocolo

1. Construção do dispositivo HIT

Prenda a mola à placa usando dois grampos e quatro parafusos (Figura 1A). Centralize os grampos em relação à largura da placa e coloque-os uns contra os outros com o grampo externo nivelado com a borda da placa. Antes de prender os grampos, dobre-os usando um alicate para encaixar firmemente sobre a mola.
NOTA: Consulte Tabela 1 para obter descrições dos materiais necessários para a construção do dispositivo HIT. A extremidade fixada da mola deve estar a 1/8 de polegada (3.2 mm) da borda da placa, e a extremidade livre deve se estender sobre a placa em 3/4 de polegada (19 mm). Ajuste a mola para que fique paralela ao comprimento da placa.
Enrole a extremidade livre da mola uma vez com a fita adesiva de laços de Velcro. A borda externa do Velcro deve estar nivelada com a extremidade da mola. O Velcro é importante porque é usado para prender o frasco à mola, criando um encaixe de compressão apertado. O Velcro também permite fácil conexão e remoção de frascos, permitindo que muitos frascos sejam processados em um curto período de tempo.
Coloque a tampa do balde de gelo de cabeça para baixo, centralizada, apertada contra a tábua de madeira. Oriente a região elevada da tampa do balde de gelo de forma que a borda longa fique paralela à largura da placa. Observe que a região elevada do balde de gelo é 1/2 polegada (13 mm) mais alta do que a tábua de madeira, de modo que, quando um frasco é preso à mola, a mola não fica plana na tábua.
Deslize todo o dispositivo contra um objeto fixo, como uma parede, de modo que a tampa do balde de gelo fique presa entre a placa e o objeto e não se mova.
Cole o transferidor de papel no fundo de uma bandeja de frasco de papelão e coloque-o na borda contra o comprimento da placa de modo que a marca de 90 ° fique alinhada com a mola quando for puxada para uma posição perfeitamente vertical.

2. Operação do dispositivo HIT

Coloque entre 1 e 60 moscas anestesiadas com CO₂ em um frasco vazio e tampe o frasco com uma bola de algodão bem ajustada.
Confine as moscas na parte inferior de 1 polegada (2,5 cm) do frasco, empurrando a bola de algodão para dentro do frasco até que esteja a 1 polegada (2,5 cm) do fundo. É útil desenhar uma linha no frasco para injetáveis na marca de 1 polegada (2,5 cm). Observe que confinar as moscas a regiões maiores ou menores do frasco pode afetar a gravidade dos fenótipos.
Aguarde 5 minutos para que as moscas recuperem a mobilidade do CO₂. Observe que não se sabe se 5 min são suficientes para remover completamente os efeitos de CO₂.
Insira a extremidade da mola no frasco para injetáveis até que a borda interna do Velcro esteja nivelada com a parte superior do frasco para injetáveis (Figura 1B). Quando a mola estiver plana, 1 polegada (2.5 cm) do frasco deve se sobrepor à região elevada da tampa do balde de gelo. Os frascos podem ser reutilizados muitas vezes.
Enquanto estiver sentado, segure o frasco na região do Velcro usando o polegar e o indicador da mão esquerda. Segure a prancha firmemente na bancada usando a mão direita. Como alternativa, use grampos C para segurar a placa firmemente na bancada.
Puxe a mola perfeitamente reta de volta para o ângulo desejado. Solte a mola. Deixe a mola parar completamente.
Retire o frasco da fonte e deixe as moscas recuperarem durante ≥5 min. Sujeite as moscas a outro ataque ou transfira as moscas para um frasco com comida para moscas.
NOTA: Uma variedade de ensaios pode ser usada para avaliar os efeitos fenotípicos dos golpes do dispositivo HIT. Por exemplo, os efeitos na longevidade podem ser determinados pela análise da porcentagem de moscas que sobrevivem às vezes após a lesão, os efeitos na morfologia do cérebro podem ser determinados pela análise histológica da cabeça e os efeitos na expressão gênica podem ser determinados pela análise quantitativa dos níveis de mRNA.
Determine os efeitos do procedimento que não são devidos a greves, tratando de forma idêntica as moscas de controle que não estão sujeitas a greves. Use proteção auditiva porque o impacto do frasco contra a tampa do balde de gelo produz um ruído alto.

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Resultados

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Figura 1: Diagrama do dispositivo HIT. (A) Ilustração da vista superior do dispositivo HIT na posição de repouso. (B) Ilustração da vista lateral do dispositivo HIT. A mola é mostrada na posição de repouso (vermelho escuro) e desviada para 90° (vermelho claro).