Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de lentivírus (etapa opcional)
- Divida três placas de 10 cm de células HEK293T para cada lentivírus a ser feito na presença de 10 ml de DMEM / 10% FBS e cresça até ~ 60-70% de confluência. Cultive células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
- Transfecte os seguintes plasmídeos de DNA (10 μg no total) em cada placa usando qualquer reagente de transfecção: 6,4 μg de vetor lentiviral CAG-Flex-GFP, 1,2 μg de pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 μg de pRSV-Rev e 1,2 μg de pMDLg/pRRE. Os três vetores de embalagens lentivirais estão disponíveis comercialmente.
nota: Essa abordagem utiliza vetores lentivirais de 3ª geração, mas os vetores de 2ª geração e os plasmídeos associados também funcionarão.
- Prepare um recipiente de resíduos contendo uma solução de alvejante a 10% dentro de um capô certificado BSL2 para inativar quaisquer soluções ou dispositivos que entrem em contato ou contenham lentivírus. Em seguida, remova completamente o meio 4-6 horas após a transfecção na solução de alvejante, substitua pelo mesmo volume de novo meio e deixe as células crescerem.
- Após 4 dias, colete o meio em tubos cônicos de 50 ml e centrifugue a 1.000 x g por 15 min para pellet quaisquer detritos celulares. Em seguida, filtre o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 μm. Qualquer filtro de baixa ligação a proteínas, como PVDF, funciona bem. cuidado: Coloque os resíduos virais sólidos e líquidos na solução de alvejante.
- Carregar 30 ml de sobrenadante filtrado em tubos de ultracentrífuga e numa ultracentrífuga. Centrifugue a 100.000 x g por 2.5 horas a 4 ° C. Abra os tubos da centrífuga em uma capa BSL2 e remova o sobrenadante em alvejante a 10%. Adicione ~ 100 μl de PBS ao pellet, o que produz títulos de 1x107 a 1x108 unidades infecciosas / ml. Alíquota no dia seguinte e armazenar a -80 ºC. As alíquotas de lentivírus são estáveis a -80 °C durante pelo menos seis meses.
- Consideração importante: Muitas instituições agora têm núcleos virais. Adquira vírus concentrado com um título mínimo de 1x107 unidades infecciosas/ml, para obter os melhores resultados.
2. Camundongos doadores para dissecção de MGE
- Primeiro, configure um acasalamento cronometrado entre uma linha de interesse que expressa Cre e um camundongo de tipo selvagem (WT) ou um camundongo que expressará um repórter após a recombinação mediada por Cre.
nota: Muitas linhagens Cre-driver são transgênicas e são mantidas e criadas no estado hemizigoto. Assim, apenas metade dos embriões conterá o transgene Cre. O DNA pode ser rapidamente preparado a partir dos embriões para uma breve PCR para detectar o alelo Cre. Os embriões Cre+ podem então ser colhidos para que apenas o tecido MGE do genótipo desejado seja usado. Alternativamente, um repórter dependente de Cre pode ser usado para selecionar os embriões para dissecção e transplante de MGE.
- Calcule qual dia corresponderá a E13.5. Se os animais foram emparelhados na noite anterior, o dia do plugue é 0,5. Encomende camundongos prenhes cronometrados ou uma fêmea WT com filhotes P1 para cronometrar o tempo de ter camundongos pós-natais (P)1 no dia em que o tecido do doador será E13.5. Alternativamente, configure esses acasalamentos em casa uma semana antes do emparelhamento dos animais doadores.
nota: A estratégia anterior de gerar embriões/filhotes E13.5 e P1 para o mesmo dia é muitas vezes difícil de fazer de forma confiável.
3. Preparação de Mídias, Ferramentas e Equipamentos.
- Prepare os reagentes e ferramentas para a preparação das células MGE (Tabela 1).
- Prepare uma superfície limpa e coloque pinças, tesouras e uma faca microcirúrgica ou pinça fina (para dissecção precisa do tecido) na superfície.
- Prepare a solução salina balanceada de Hank (HBSS) para dissecção e o meio de águia modificado de Dulbeco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) para transdução.
- Pré-incubar 20-30 ml de DMEM/10% FBS em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C por cerca de 1 hora. A tampa deve ser afrouxada para permitir a troca gasosa e o equilíbrio do pH do meio.
nota: A pré-incubação do meio pode ser preparada imediatamente antes de iniciar a dissecação.
4. Preparação de células MGE
- Sacrifique a rata grávida de acordo com um protocolo animal aprovado e remova os embriões para uma placa de Petri de 10 cm contendo HBSS gelado.
- Remova o cérebro de cada embrião usando um escopo de dissecação (faça um de cada vez, deixando o resto dos embriões em HBSS gelado) e, em seguida, corte o tecido MGE.
nota: Detalhados abaixo e na Figura 1 estão as principais etapas que mostram como remover o MGE.
- Posicione o cérebro com o lado ventral voltado para cima (Figuras 1A, A'). Nota: também não há problema em ter o aspecto dorsal voltado para cima. Corte o cérebro ao meio ao longo do plano sagital para gerar dois pedaços. Um exemplo de cérebro hemisseccionado é mostrado (Figuras 1B, B '); observe que os aspectos dorsal (o córtex sobrejacente) e ventral da cobertura cerebral circundam o tecido da eminência ganglionar (GE).
- Em seguida, com uma mão dominante, segure uma pinça muito fina ou uma facada (Tabela 1) enquanto imobiliza o hemisfério com uma pinça segurada por uma mão não dominante. (O aspecto medial do hemisfério deve estar voltado para cima). Desdobre o tecido dorsal e ventral com uma pinça e uma faca para revelar o tecido GE subjacente (Figura 1C e diagramado na Figura 1C').
nota: A remoção de alguns meios da placa de Petri de dissecção pode facilitar a estabilização do tecido durante a dissecção do MGE.
- Faça cortes retos com a faca ou pinça fina para separar o CGE, LGE e os tecidos septais (veja exemplos de cortes denotados por linhas tracejadas vermelhas, Figuras 1D e D'). Esses cortes podem ser feitos em qualquer ordem.
nota: Imagine o MGE como uma 'caixa' que é cortada do tecido circundante. Isso ajuda a fazer cortes semelhantes de forma reprodutível para cada dissecção, reduzindo assim a variabilidade nas dissecções de tecido.
- Por fim, vire o MGE de lado e corte a parte inferior (que era o aspecto lateral do cérebro). Isso remove a zona do manto do MGE (descartar nas Figuras 1E e 1E') do resto do MGE. O aspecto restante do MGE contém principalmente porções da zona ventricular e da zona subventricular do MGE, que contêm quase todas as células progenitoras do MGE. Prossiga com este tecido.
- Consideração importante: A adição de gel de silicone ao fundo de uma placa de Petri pode servir como uma excelente superfície de dissecação, pois protege as pontas delicadas da pinça e fornece uma superfície macia para prender o tecido com uma pinça.
5. Marcação e transplante lentivirais
- Mova os tubos de tecido MGE para um capuz certificado BSL2 e remova a mídia.
nota: O tecido MGE é grande o suficiente para ser visível e se depositará no fundo do tubo, permitindo que o meio frio seja removido com facilidade e cuidado.
- Adicione ~ 500 μl de meio DMEM / 10% FBS, que foi pré-incubado em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C. Em seguida, adicione polibreno para facilitar a transdução para cada tubo a uma concentração final de 8 μg / ml. Triturar o tecido MGE para criar uma suspensão de célula única usando uma ponta de pipeta P1000. Finalmente, adicione ~ 15-20 μl de lentivírus concentrado a cada tubo.
- Consideração importante: Uma trituração de 10 a 12 vezes é suficiente para quebrar o tecido MGE de um único embrião, mas mais triturações podem ser necessárias se vários MGEs forem agrupados. Experimente diferentes condições de trituração para determinar o que funciona melhor.
- Feche bem cada tubo, inverta para misturar e coloque todos os tubos em uma incubadora a 37 °C. Incube as células no lentivírus por pelo menos 30 min e até 1 hora, tempos mais longos resultaram em diminuição da viabilidade celular. Inverta os tubos a cada 10 minutos até que o tempo acabe.
- Após a incubação com lentivírus, remova os tubos da incubadora e centrifugue a ~ 700 x g por 3 min para pellet as células. No capô BSL2, remova o sobrenadante e descarte em 10% de alvejante. Em seguida, adicione 1 ml de DMEM/10% FBS e triture o pellet 2-3 vezes para lavar, depois centrifugue novamente na mesma velocidade para pellet as células. Repita esta etapa de lavagem mais 2 a 3 vezes para remover o excesso de vírus.
nota: Executar etapas de centrifugação a 4 °C; no entanto, a viabilidade reduzida não foi observada quando spins curtos são realizados em RT.
- Após a lavagem final, remova o máximo de mídia possível e coloque cada tubo no gelo. Devido ao meio residual nas laterais do tubo, ~ 2-3 μl de meio acabará cobrindo o pellet celular no momento em que o procedimento de transplante for iniciado.
6. Transplante e Validação
- Adquira os filhotes P1 do hospedeiro e prepare a área do procedimento pulverizando com etanol 70%. Para manter a esterilidade durante o procedimento, recomenda-se realizar esses procedimentos em uma sala de procedimentos limpa dedicada. Além disso, use ferramentas cirúrgicas autoclavadas e esterilize as superfícies com as quais os filhotes entrarão em contato, usando etanol 70%. Um exemplo de equipamento representativo necessário para a realização dos transplantes, e uma área de procedimento representativa, é mostrado na Figura 2.
Nota: Embora este procedimento seja uma injeção de pequenos volumes, e não um procedimento cirúrgico que exija uma incisão, ferida aberta ou suturas, ainda é recomendado que uma nova micropipeta seja usada para cada camundongo a ser injetado. As micropipetas são esterilizadas termicamente quando puxadas e chanfradas em uma superfície que foi pulverizada com etanol 70% sendo armazenada em um recipiente lacrado.
- Gere micropipetas para ter um diâmetro na ponta entre 40-80 μm. Seguir essas dimensões produzirá ótimos resultados. Esterilize as micropipetas quando puxadas e chanfradas em uma superfície e borrife com etanol 70% antes de armazená-las em um recipiente lacrado.
Nota: Em alternativa, se o acesso aos dispositivos necessários para criar estas agulhas (Quadro 1) for limitado, utilize qualquer outro dispositivo de injeção. No entanto, estes podem não ser tão adequados quanto as micropipetas devido aos diferentes diâmetros.
- Retire o óleo mineral para uma seringa de 1 ml e, com uma agulha de 30 1/2 G, encha completamente a pipeta de vidro com óleo mineral. Em seguida, monte o êmbolo no dispositivo estereotáxico, depois conecte a pipeta de vidro ao dispositivo estereotáxico e carregue-o no êmbolo. Usando o acionamento hidráulico, mova o êmbolo até a metade da pipeta de vidro, removendo o óleo mineral que derrama com uma toalha de papel limpa.
- Alternativa ao uso de uma seringa, mergulhe a extremidade traseira da pipeta em óleo mineral e encha por ação capilar. Para evitar bolhas de ar na pipeta, mantenha a pressão positiva na seringa até que esteja completamente fora da pipeta de vidro.
nota: Outros dispositivos podem ser usados para transplantar células MGE com sucesso. Qualquer dispositivo que possa fornecer um volume menor ou próximo a 100 nl funciona bem para este procedimento.
- Em seguida, use uma toalha de papel estéril ou qualquer material absorvente, com o canto torcido em uma ponta fina para remover delicadamente o excesso de mídia acima do pellet da célula MGE. Esta etapa concentra a densidade celular para que volumes de injeção menores possam ser alcançados. Em seguida, use uma pipeta de baixo volume (P2 é o preferido) para puxar lentamente o pellet celular e triturar 1-2 vezes antes de mover a suspensão celular para uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser ligeiramente inferior a 1 μl. Mova a ponta da agulha para dentro da suspensão da célula e, usando o acionamento hidráulico, puxe a suspensão da célula para a pipeta.
- Anestesie um filhote P1 por hipotermia (enrole em uma luva de látex e coloque no gelo por ~ 2-4 min). Verifique a eficácia da anestesia com um estímulo nocivo. Aperte a pele entre os dedos dos pés com uma pinça fina: o filhote não deve responder se for beliscado. Em seguida, coloque o filhote em um molde que esteja sob o dispositivo de injeção e, em seguida, estique a pele puxando a pele da cabeça para trás e prendendo com fita adesiva padrão.
nota: Embora a hipotermia seja muito eficaz em camundongos neonatais e resulte em uma baixa taxa de mortalidade, os procedimentos devem ser feitos rapidamente, pois os filhotes começarão a se recuperar em menos de 10 minutos. Além disso, 4 minutos no gelo é um limite superior do que pode ser tolerado. Tente induzir a hipotermia apenas uma vez se for necessário mais tempo para as injeções. No entanto, se um filhote se recuperar cedo, primeiro permita que ele se recupere totalmente antes de induzir a hipotermia novamente. Além disso, apenas induza a hipotermia mais uma vez para realizar injeções. Os filhotes se recuperarão dentro de 5 a 10 minutos após a hipotermia. Isso pode ser facilitado colocando os filhotes com a ninhada e a mãe ou colocando o filhote em uma superfície quente para se recuperar.
- Usando um dispositivo estereotáxico, posicione a ponta da pipeta de vidro na superfície da cabeça do filhote, perpendicular à superfície da cabeça. Quando a pipeta estiver em contato com a cabeça, considere isso como '0'. Em seguida, empurre a pipeta através da superfície da pele e do crânio para o córtex, depois insira e retraia a pipeta ~ 2 vezes antes de parar. Para um direcionamento ideal das células para o neocórtex, as injeções são realizadas quando a micropipeta está a uma profundidade de 0,1 mm. No entanto, isso deve ser otimizado pelo usuário (veja nota abaixo).
nota: Embora essa profundidade atinja de forma confiável as camadas neocorticais mais profundas com os dispositivos descritos acima, algumas profundidades devem ser testadas e determinadas empiricamente. Além disso, uma variedade de profundidades em diferentes posições rostro-caudais e médio-laterais deve ser testada para determinar qual profundidade é ideal em cada local. Além disso, a punção inicial deve ser rápida, pois a penetração lenta no neocórtex diminui a capacidade de penetrar no tecido de forma limpa. Experimente velocidades diferentes ao iniciar este procedimento pela primeira vez para descobrir o que funciona melhor. Além disso, para testar coordenadas, não há substituto real para o uso de células marcadas, pois os corantes não são confiáveis para denotar posição.
- Quando a agulha estiver na posição, gire o dispositivo hidráulico para avançar o êmbolo na pipeta de vidro, empurrando um volume definido de suspensão celular para o córtex. Injete 50-70 nls por local. Repita este procedimento em 3-6 locais diferentes em diferentes níveis rostral-caudais se o objetivo for obter uma ampla distribuição de células em todo o neocórtex.
nota: Volumes de 100 nl ou mais podem causar lesões e levar a grandes aglomerados de células injetadas que não conseguem migrar eficientemente para fora do local da injeção. Assim, volumes de injeção menores (~ 70 nl ou menos) são ideais, em mais locais, se o tempo permitir.
- Quando as injeções estiverem completas, remova o filhote do palco e marque-o (o corte do dedo do pé é uma maneira confiável de identificar os filhotes mais tarde). Assim que o filhote se recuperar e for capaz de se mover sozinho (isso ocorre minutos após removê-lo do palco), coloque-o de volta com a mãe e a ninhada.
nota: Por se tratar de um procedimento minimamente invasivo, não há procedimentos pós-cirúrgicos, uma vez que o filhote está se movendo livremente e aquecido. No entanto, os filhotes devem ser verificados não apenas após o procedimento, mas também no dia seguinte para garantir que não tenham sinais de deterioração da saúde.
- Antes de iniciar o procedimento no próximo filhote, borrife a área com etanol 70% para manter uma área de trabalho estéril. Permita que os filhotes injetados se desenvolvam e, em seguida, avalie o tecido no(s) estágio(s) de desenvolvimento apropriado(s).
Tabela 1. Lista de inventário de reagentes e ferramentas.Um inventário de reagentes disponíveis comercialmente, incluindo meios, ferramentas de dissecação, equipamento representativo para transplante e vetores de ADN. (n.a.) Não disponível nem aplicável.
5
| Reagentes e equipamentos para preparação e transdução de células MGE | Catálogo # | companhia |
| 1) | Meio Eagle Modificado de Dulbecco, com alta glicose | 12491-015 | Tecnologias da Vida |
| 2) | Calor inativado Fetal Soro Bovino | Rolamento 10437-077 | Tecnologias da Vida |
| 3) | Hanks solução salina balanceada (HBSS), sem cálcio ou magnésio | 14170-112 | Tecnologias da Vida |
| 4) | Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (ou outros tubos de coleta com tampas) | 3810X | Eppendorf Internacional |
| 5) | Polybrene | SC-134220 | SantaCruz Biotecnologia |
| 6) | Faca reta 22,5 ° (opcional) | REFERÊNCIA 72-2201 | Corporação de especialidades cirúrgicas |
| 7) | placa de Petri (10 cm), para dissecções de tecidos | FB0875713 | Fisher Científico |
| 8) | 2 pinça de ponta fina, como Dumont # | 11254-20 | Ferramentas científicas finas |
| 9) | 37 °C incubadora de cultura de tecidos com 5% de entrada de CO2 | C150 | fichário |
| 10) | Centrífuga de mesa que pode girar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | | |
| 11) | Qualquer pipeta P1000 que possa ser usada para trituração celular | | |
| 12) | Capuz de nível 2 de biossegurança | | |
| Reagentes e equipamentos para culturas primárias de MGE in vitro | Catálogo # | companhia |
| 1) | Lab-TekII lâminas de câmara com tampa, 8 poços | 154941 | Thermo Fisher |
| 2) | Poli-L-lisina 0,1% peso/volume | Pág. 8920 | Sigma Aldrich |
| 3) | Laminina de camundongo, 0,5-2 mg/ml | Rolamento 23017-015 | Tecnologias da Vida |
| 4) | Meio neurobasal | Rolamento 21103-049 | Tecnologias da Vida |
| 5) | B27 suplemento sem soro | 17504044 | Tecnologias da Vida |
| 6) | Glutamax, 100x estoque | Rolamento 35050-061 | Tecnologias da Vida |
| 7) | Penicilina-estreptomicina, estoque 100x | 15070-063 | Tecnologias da Vida |
| 8) | Glicose, (prepare uma solução a 25% em água) | G5400 | Sigma Aldrich |
| Reagentes e equipamentos para transplante de células MGE | Catálogo # | companhia |
| 1) | 1 ml seringa | REF 309602 | BD, Becton Dickinson e companhia |
| 2) | 30 1/2 G agulha | 305106 | BD, Becton Dickinson e companhia |
| 3) | Furo de precisão para fornecer 5 μl (vem com êmbolo) | 5-000-1005 | Empresa científica Drummond |
| 4) | Parafilm | PM-999 | Policiências, Inc. |
| 5) ** | Microscópio estéreo com suporte de lança | MZ6 | Leica |
| 6) ** | Digital apenas para instrumentos estereotáxicos de ratos | 51725D | Empresa de estoelting |
| 7) ** | Micromanipulador fino hidráulico de óleo de eixo único | MO-10 | Narishige |
| 8) | chanfrador rotativo revestido de diamante | n.a. | Feito em casa |
| 9) | Extrator de pipeta de agulha | 730 | Instrumentos Kopf |
| 10) | Óleo mineral | n.a. | Qualquer drogaria ou farmácia |
| 11) | Qualquer pipeta e ponteiras que possam medir com segurança 1 μl de volume | | |
| ** Estes são os modelos que usamos, mas muitas outras configurações devem funcionar | |
| Reagentes opcionais (para fazer lentivírus) | Catálogo # | companhia |
| 1) | 25 mm, filtro de 0,45 μm | 09-719B | Fisher Científico |
| 2) | Tubos de centrífuga ultra-claros (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® |
| 3) | Lipofectamina 2000 | (tamanho de 1,5 ml) | 11668019 | Invitrogen |
| Outros suprimentos disponíveis comercialmente | Catálogo # | companhia |
| 1) | pMDLg/pRRE plasmídeo que codifica gag/pol | Rolamento 12251 | Addgene |
| 2) | pRSV-Rev plasmídeo que codifica Rev | 12253 | Addgene |
| 3) | pMD2.G plasmídeo que codifica VSVG | Rolamento 12259 | Addgene |
| 4) | pAAV-Flex-GFP | Rolamento 28304 | Addgene |
