Marcação e transplante mediados por vírus de células de eminência ganglionar medial para estudos in vivo

Resumo

Fonte: Vogt, D. et al., Marcação e transplante mediado por vírus de células de eminência ganglionar medial (MGE) para Estudos in vivo. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra a marcação viral e o transplante de células de eminência ganglionar medial (MGE) para estudos in vivo. Ele descreve as etapas envolvidas na transdução de células MGE com um repórter viral, transplantando essas células transduzidas para o córtex de um filhote de camundongo e permitindo a expressão do repórter em subtipos específicos de interneurônios.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de lentivírus (etapa opcional)

1. Divida três placas de 10 cm de células HEK293T para cada lentivírus a ser feito na presença de 10 ml de DMEM / 10% FBS e cresça até ~ 60-70% de confluência. Cultive células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Transfecte os seguintes plasmídeos de DNA (10 μg no total) em cada placa usando qualquer reagente de transfecção: 6,4 μg de vetor lentiviral CAG-Flex-GFP, 1,2 μg de pMD2.....

Resultados

Figura 1. Procedimento representativo para a dissecção do tecido E13.5 MGE. Exemplo de dissecção de tecido MGE para culturas primárias ou transplantes. (A-E) Imagens de dissecções cerebrais E13.5 e esquemas (A'-E') para destacar estruturas e etapas importantes no procedimento. (A, A') Cérebro E13.5 representativo visto do aspecto ventral. A linha ve.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes e equipamento para transplante de células MGE
Seringa de 1 ml	REF 309602	BD, Becton Dickinson e companhia
301/2 agulha de calibre	305106	BD, Becton Dickinson e companhia
Furo de precisão para fornecer 5 μl (vem com êmbolo)	5-000-1005	Empresa científica Drummond
Parafilme	PM-999	Policiências, Inc.
Microscópio estéreo com suporte de lança **	MZ6	Leica
Instrumento estereotáxico digital apenas para ratos **	51725D	Empresa de roubo
Micromanipulador fino hidráulico de óleo de eixo único **	MO-10	Narishige
Chanfrador rotativo revestido de diamante	n.a.	Feito em casa
Extrator de pipetas de agulhas	730	Kopf instruments
Óleo mineral	n.a.	Qualquer drogaria ou farmácia
Qualquer pipeta e ponteiras que possam medir 1 μl de volume
** Estes são os modelos específicos que usamos, mas muitas outras configurações devem funcionar
Reagentes opcionais (para fazer lentivírus)
25 mm, filtro de 0,45 μm	09-719B	Fisher Scientific
Tubos de centrífuga ultra-claros (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (tamanho de 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Outros suprimentos disponíveis comercialmente
pMDLg/pRRE plasmídeo que codifica gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmídeo que codifica Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmídeo que codifica VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene