$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Procedimento pré-cirúrgico
- Antes de iniciar a cirurgia, limpe tudo com etanol a 70% para manter as condições estéreis. Recomenda-se o suporte térmico usando uma almofada de aquecimento.
- Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg / kg). Confirme a anestesia realizando uma pinça no dedo do pé. Recomenda-se o uso de meloxicam SR na indução e buprenorfina após a recuperação BID (bis in die, duas vezes ao dia) por pelo menos 24 horas.
- Raspe o cabelo com um aparador cirúrgico. Fixe um camundongo no adaptador de camundongo e rato neonatal usando barras auriculares e uma pinça nasal.
nota: É fundamental certificar-se de que a cabeça do mouse esteja presa neste estágio e não se mova lado a lado.
- Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
2. Cirurgia Estereotáxica para Implante de Cânula Guia
- Coloque o adaptador de camundongo e rato neonatal no aparelho estereotáxico. Faça uma incisão sagitalmente na pele sobre o crânio usando um bisturi. Limpe o sangue e o tecido conjuntivo do crânio usando um cotonete úmido.
- Determine a coordenada da região cerebral de interesse usando o atlas cerebral. Antes de iniciar as medições, certifique-se de que a linha média esteja reta para que a broca possa ser movida de A a P e permanecer na sutura da linha média o tempo todo.
nota: Este artigo usa a coordenada (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 graus) para atingir o hipocampo posterior.
- Nível crânio AP
- Anexe uma broca em um manipulador de uma estrutura estereotáxica. Abaixe a broca até que ela toque suavemente lambda e registre sua coordenada ventral. Repita este procedimento para bregma.
nota: Quando o crânio é nivelado, a medida vertical de bregma é igual à de lambda. Caso contrário, ajuste a altura do grampo nasal de acordo. Depois que o crânio for nivelado, registre a coordenada anterior / posterior e lateral do bregma.
- Crânio nivelado esquerda-direita
- Mova a broca do bregma para a coordenada (Ântero-posterior [A/P]: -3,1 mm, mediolateral [M/L]: +2,0 mm), abaixe a broca até o crânio e registre a coordenada vertical. Em seguida, repita este procedimento para a coordenada (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm).
nota: Se o crânio estiver nivelado, essas medidas verticais de dois pontos equidistantes da linha média são iguais. Caso contrário, ajuste a altura das barras auriculares.
- Faça um furo de rebarba cuidadosamente na coordenada alvo (A/P: -3.1 mm, M/L: -2.5 mm) para implantar uma cânula guia. Se o diâmetro de um orifício de rebarba não for grande o suficiente para o implante de uma cânula guia, faça outro orifício que se sobreponha ao primeiro. Faça outro orifício no osso parietal direito (lado contralateral) e insira um parafuso ósseo, que ajuda a fixar o cimento dentário em 1.10 (ver Figura 1B).
- Corte uma peça de travamento circular da parte de trás da tampa de um tubo de centrífuga de 1,5 mL com uma lâmina de barbear e faça uma ''coroa''. Esta coroa é usada para evitar que o cimento dental se espalhe para a pele. Coloque-o no crânio de forma que os orifícios feitos na etapa 2.5 fiquem dentro do círculo (veja a Figura 1).
- Configure um conjunto estereotáxico colocando uma cânula guia no braço mais curto de um adaptador estereotáxico e prenda-o usando uma porca de capa. Coloque o braço mais longo do adaptador estereotáxico no eletrodo clamp. Fixe-o no manipulador do aparelho estereotáxico (ver figura 1A).
- Gire o conjunto estereotáxico dorsal-ventral (DV) no braço manipulador em 12 graus (consulte a Figura 1B). Mova a cânula guia para o orifício da rebarba feito em 1.6. Insira a cânula guia lentamente no cérebro, abaixando-a em 1,2 mm.
nota: O ângulo da sonda é específico para o hipocampo; outras regiões podem exigir outros ângulos ou nenhum ângulo. Consulte um atlas cerebral para coordenadas precisas. Seque a superfície do crânio, porque se não o cimento não vai grudar e a tampa de cimento pode se desalojar
- Adicione o cimento dentário dentro da coroa para cobrir totalmente a parte metálica da cânula guia e o parafuso ósseo o suficiente para prendê-los. Aplique cimento dental adicional se houver uma parte do crânio exposta.
- Aguarde até que o cimento dentário esteja completamente seco (~12-20 min). Remova o adaptador estereotáxico do eletrodo clamp. Remova a porca de capa e substitua o adaptador estereotáxico por uma sonda fictícia e aperte a porca de capa.
- Solte o mouse do aparelho estereotáxico e aloje-o sozinho em uma gaiola individual.
nota: O camundongo não deve ser deixado sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Verifique o mouse diariamente até o dia da microdiálise. O camundongo recebe anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), como o carprofeno, se parecer estar com dor. É necessário esperar 2 semanas para estudos de sono-vigília para que o camundongo se habitue ao novo ambiente, mas outros tipos de estudos podem exigir períodos de recuperação mais curtos (por exemplo, 1-2 dias).
3. Configuração da microdiálise
- Verificação de qualidade das sondas: Encha uma seringa descartável de 1 ml com água destilada e conecte-a à saída (porta mais curta) de uma sonda usando um tubo byton. Cubra os orifícios de ventilação com os dedos e pressione suavemente o êmbolo da seringa para infundir água na sonda. Verifique se a água sai da entrada da sonda e se não há vazamento na superfície de uma membrana de microdiálise.
- Ativação de sondas: Mergulhe as membranas de uma sonda em etanol (70-100%) por dois segundos. Em seguida, infunda novamente água destilada na sonda com uma seringa.
- Preparação do tampão de perfusão: Para evitar a adesão de moléculas-alvo aos tubos, adicione BSA diluindo a solução de BSA a 30% a 4% com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF: 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH = 7,35), que se aproxima da concentração de eletrólitos no LCR, imediatamente antes do uso. Filtre o tampão de perfusão através de uma unidade de filtro de seringa com tamanho de poro de 0,1 μm.
NOTA: A albumina sérica bovina (BSA) a 4% melhora a recuperação de proteínas aderentes, mas pode limitar severamente a entrega de compostos, especialmente para compostos com alta ligação à BSA. Esta é uma vantagem de usar uma concentração mais baixa de BSA (como 0,15%) em certos casos. Observe que o BSA pode se agregar muito facilmente quando agitado por vórtice ou placa de agitação. Esses agregados podem entupir sondas ou poros de membrana. Tenha cuidado ao preparar uma solução BSA para limitar essa agregação
- Prepare duas linhas separadas para entrada e saída (consulte a Figura 1C) e conecte ambas as linhas com uma agulha de conexão. Encha uma seringa descartável de 3 mL cheia de tampão de perfusão e conecte-a à extremidade de entrada do tubo usando uma agulha de ponta romba. Encha todo o tubo com um tampão de perfusão executando a bomba de seringa.
- Pare a bomba de seringa e substitua a agulha de conexão entre a linha de entrada e a linha de saída por uma sonda de microdiálise ativada da etapa 3.3 (consulte a Figura 1C). Antes desta substituição, coloque a porca de capa na sonda.
- Monte o tubo do rolo na tubulação de saída da bomba do rolo. Ligue a bomba de seringa a 10 μL/min e, em seguida, a bomba de rolos a uma taxa de fluxo ligeiramente mais lenta (9,5-9,8 μL/min). Certifique-se de remover todas as bolhas de ar em toda a tubulação, o que pode influenciar a recuperação quando elas entrarem na sonda.
- Anestesiar o mouse da etapa 1.12 da mesma forma que na etapa 1.2. Coloque a coleira do rato em volta do pescoço. Remova a porca de capa e a sonda fictícia e insira lentamente uma sonda de microdiálise de 3.4 através da cânula guia e aperte a porca de capa.
- Coloque o mouse na gaiola conectada a um sistema de movimento livre e amarre o mouse com a coleira. Continue funcionando a bomba de seringa e a bomba de rolo na vazão indicada na etapa 3.5 por pelo menos 1 h.
nota: Para obter a coleta de ISF de animais acordados, este artigo usa um sistema de movimento livre, onde a própria gaiola responde ao movimento de um animal para evitar que os tubos se torçam. Alternativamente, também podem ser usados giros líquidos disponíveis em várias empresas.
- Pare primeiro a bomba de rolos e depois a bomba de seringa. Defina a taxa de fluxo desejada. Opere a bomba de seringa 20% mais rápido que a bomba de rolos.
nota: Por exemplo, se você funcionar a 1 μL/min, opere a bomba de seringa a 1,2 μL/min. A taxa de fluxo ideal deve ser determinada empiricamente para cada molécula.
- Coleta de amostras ISF: colocar a extremidade livre da tubulação de saída no coletor de frações refrigeradas.
nota: O volume de amostra apropriado varia de acordo com os ensaios usados para análise.
- Após a conclusão do experimento, remova a sonda. (Anestesie o mouse conforme necessário.)Manipule a recuperação do mouse da mesma forma que na etapa 2.11. Analise o ISF coletado por métodos como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
- Para lavar toda a tubulação após a microdiálise, conecte as tubulações de entrada e saída novamente, substituindo a sonda pela agulha de conexão e passe o alvejante diluído em toda a tubulação e, em seguida, lave-a com água. Seque e guarde para uso repetido.
nota: Outros tipos de tubos são aceitáveis, no entanto, o BSA no tampão de perfusão pode entupir os tubos com pequeno diâmetro, portanto, esses tubos são considerados de uso único. Os tubos podem ser desgastados ou entupidos após vários usos, portanto, certifique-se de que a taxa de fluxo seja consistente todas as vezes antes do uso.
