Modelo de invasão tumoral baseado em matriz usando co-cultura de glioblastoma de microglia

Resumo

Fonte: Coniglio, S., et al. Ensaios de cocultura para estudar a estimulação de macrófagos e micróglias da invasão de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, as células de glioblastoma e microglia são misturadas com uma solução de matriz polimérica e transferidas para uma inserção de câmara porosa onde um gel se forma, incorporando as células. A microglia estimula a migração das células de glioblastoma através da inserção porosa, imitando a invasão de células tumorais no tecido circundante, As células são então fixadas e preparadas para análise posterior.

Protocolo

1. Marcação fluorescente de células

NOTA: Rotule linhagens celulares de glioblastoma e microglia com corantes fluorescentes 9. Alternativamente, gere linhagens celulares que expressem constitutivamente proteínas fluorescentes, como GFP / RFP.

1. Células da placa em uma placa de 6 poços de modo que sejam 70 - 80% confluentes no dia da coloração. Para a linha celular de glioblastoma murino GL261 e a linha celular de glioblastoma humano U87, coloque 1 x 10⁶ e 1,5 x 10⁶, respectivamente, em um prato de 6 cm 24 horas antes da coloração.
2. Prepare a solução de corante de corante de células fluorescentes em DMSO (dimetilsulfóxido) e adicione 5 μM de corante ao meio, seja meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ou meio livre de soro de macrófagos (MSFM), bem de vórtice.
3. Incubar células com corante por 30 min a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Remova o corante contendo mídia e adicione mídia nova (RPMI ou MSFM) às células.
5. Incube as células por 30 min. Nota: As células agora estão coradas e prontas para serem usadas no experimento.

2. Ensaio de invasão "3D" - incorporando glioma e macrófagos / microglia na matriz

1. Descongele a mistura de matrizes a 4 °C durante a noite. Execute todas as manipulações adicionais usando uma matriz no gelo no capô.
2. Prepare a concentração de 10 mg / ml de matriz em meio (MSFM ou RPMI) com 0,3% de BSA no gelo.
   NOTA: A concentração de estoque da matriz é normalmente de cerca de 15 mg/ml.
3. Para preparar as células (marcadas na etapa 1) para suspensão na matriz, remova o meio das células por aspiração. Lave as células em um prato com 2 mM de EDTA (ácido etilenodiamina tetracético) / PBS (solução salina tamponada com fosfato). Adicione 500 μl de EDTA/PBS 2 mM às células e incube durante 5 a 10 min a 37 °C e 5% de CO₂.
4. Ressuspenda as células em 5 ml de meio contendo 0,3% de BSA.
5. Centrifugue por 5 min a 120 x g.
6. Aspirar o sobrenadante do sedimento. Ressuspenda o pellet em meio / 0,3% BSA de modo que a concentração de células seja igual a 1 x 10 ⁶ células / ml. Use um hemocitômetro para contar as células.
7. Adicione 1,5 x 10⁵ células GL261 (em 150 μl) + 5 x 10⁴ células microglia (em 50 μl) em um tubo de microflúcia de 1,5 ml. Adicione 2 x 10⁵ células GL261 (200 μl) em um tubo de microfífugo separado de 1,5 ml.
   NOTA: As células GL261 sozinhas sem microglia servem como controle.
8. Gire as células em uma microcentrífuga por 5 min a 120 x g.
9. Ressuspender as células em 200 μl de matriz fria em gelo.
10. Coloque 50 μl (50.000 células) no centro do compartimento superior do inserto da câmara de tamanho de poro de 8 μM.
11. Incubar a 37 °C por 30 min para que ocorra a polimerização.
12. Adicionar 200 μl de meio isento de soro à câmara superior e 700 μl de meio de crescimento celular contendo soro ao poço inferior.
13. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 48 horas.
14. Após a incubação, remova as células do topo da câmara por aspiração suave e fixe as câmaras colocando-as em formaldeído a 3,7% em PBS. Deixe as câmaras permanecerem no fixador por 15 min à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 °C). Remova o fixador por aspiração suave e substitua por 500 μl 1x PBS. Prossiga para a seção 4 para análise de imagem.

Resultados

Figura 1: Esquema de dois protocolos diferentes para testar a invasão de células de glioblastoma estimuladas por micróglia/macrófagos. O painel superior ilustra o ensaio de invasão da câmara de matriz pré-revestida. O painel inferior ilustra o ensaio de invasão de matriz 3D.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara de Invasão de Matrigel BioCoat da Corning: Com Matriz de Matrigel BD	Corning/Fisher Scientific	Gato: 354481
Meio livre de soro de macrófagos (MSFM) (500 ml)	Tecnologias de Vida	12065-074
Corante CellTracker Red CMTPX	Tecnologias de Vida/Sondas Moleculares	C34552
Corante CellTracker Verde CMFDA	Tecnologias de Vida/Sondas Moleculares	C2925
Linha celular GL261	Instituto Nacional do Câncer (NCI)
Linhagem celular THP-1	Coleção Americana de Cultura de Tipo de Tecido	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Médio (500 ml)	Tecnologias de Vida/Gibco	11875-093
Solução de formaldeído	Sigma Aldrich	F1635
Inserções de cultura de células de membrana de policarbonato Corning Transwell (poro de 8 μM) 48 por embalagem.	Corning	CLS3422
Extrato de Membrana Basal de Fator de Crescimento Reduzido de Matriz de Cultura 3-D Cultrex, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Soro fetal de bezerro (FBS)	Tecnologias de Vida	Gato: 10500064
Albumina de Soro Bovino, Fração V, Tratada com Choque Térmico	Fisherscientific	BP1600-100
0.5M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020