Infecção pelo vírus Zika de células-tronco neurais fetais

Resumo

Fonte: McGrath, E. L., et al., Infecção pelo vírus Zika de células-tronco neurais cerebrais fetais humanas cultivadas para análise imunocitoquímica. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um procedimento para infectar células-tronco neurais fetais humanas com o vírus Zika. As células infectadas podem ser usadas para estudos adicionais.

Protocolo

1. Infecção pelo vírus Zika

NOTA: O ZIKV é altamente sensível à temperatura, por isso é imperativo que o estoque de ZIKV seja armazenado a -80 °C e que os ciclos de congelamento/descongelamento sejam evitados. Continue trabalhando alíquotas no gelo.

1. Células de passagem. 3-4 milhões de células no total são necessárias para semear uma placa de 24 poços, portanto, ao passar, coloque o número de células necessárias para infecção e semeadura em um frasco durante a passagem.
2. Se semear células em uma placa de 24 poços para coloração, prepare a placa [Cubra os poços contendo lamínulas com 0,01% de poli-D-lisina (PDL) em água estéril e incube por 1 h a 37 ° C. Para uma placa de 24 poços, use 250 μL de PDL por poço].
3. Após a passagem, coloque 1 mL de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 200 x g em temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, remova o sobrenadante por aspiração.
4. Ressuspenda o pellet celular no estoque de ZIKV para adquirir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 a 10. O volume da solução de ZIKV não deve exceder 0,5 mL. Para o tratamento simulado (células controle), ressuspenda as células no mesmo volume e tipo de meio utilizado no estoque de ZIKV.
5. Incubar acima da mistura célula/ZIKV a 37 °C por 1 h. Inverta o tubo 2-3 vezes e, em seguida, centrifugue a mistura por 5 min a 216 x g em temperatura ambiente para obter um pellet de célula. Ressuspenda o pellet em dPBS e centrifugue novamente por 5 min a 216 x g à temperatura ambiente.
6. Remover o sobrenadante por aspiração, ressuspender as células com o meio adequado e colocar as células infectadas no balão ou na placa necessária para a experiência. Se semear as células em uma placa de 24 poços, ressuspenda o pellet em 12 mL de meio apropriado e, em seguida, adicione 500 μL de suspensão a cada poço.
   NOTA: Neste ponto, mantenha as células em meios de crescimento para observar os efeitos do ZIKV nas células-tronco ou vá para as etapas 6 ou 7 para estudar o efeito do ZIKV no processo de diferenciação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glicose (10%)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Estreptococos da caneta (100x)	Gibco	15140-122
Incubadora de dióxido de carbono	Thermo Forma	Modelo# 3110
Centrífuga	Thermo fisher Scientific	75004221
Armário de segurança biológica	Forma científica Claas II A/B3	Modelo# 1284
Bromidrato de poli-D-lisina (PDL)	Sigma	Pág. 6407-5MG
Laminina	Invitrogen	23017-015