Estimulação de neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal usando um agonista do receptor neuropeptídico

Resumo

Fonte: Lin, Y., et al., Isolamento dos gânglios da raiz dorsal e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o uso de células ganglionares da raiz dorsal transfectadas para estudar a liberação de neurotransmissores, estimulando-as com um agonista do receptor neuropeptídico.

Protocolo

1. Liberação de neurotransmissores de células DRG primárias

1. No dia 6, após as células serem plaqueadas (72 h após a transfecção de siRNA), mude o meio de cultura para 200 μL de meio livre de soro e incube as células em uma incubadora de CO₃₇ ° C 2 por 30 min.
2. Adicione 1 μL de produto químico (s) de estimulação e misture suavemente o meio pipetando. Incubar o prato em uma incubadora de CO₃₇ °C 2 pelo tempo designado.
   nota: Neste artigo, as células cultivadas foram estimuladas com o agonista NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), por 1 h.
3. Recolher o meio de cultura da placa de cultura e centrifugar a 5 000 x g durante 5 min a 4 °C para remover quaisquer impurezas em suspensão.
4. Colete o sobrenadante da centrifugação e dilua as amostras com solução salina tamponada com fosfato (PBS) conforme necessário. Em seguida, use kits de imunoensaio enzimático (EIA) para testar os níveis de neurotransmissores.
   nota: Aqui, os sobrenadantes foram diluídos 1:100 antes de analisar o nível de CGRP. O sobrenadante não foi diluído antes da análise do nível de PS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Meio de Cultura
Solução salina balanceada de Hank	Invitrogen	14170-112	Meio de Cultura
Pipeta Pasteur	Hilgenberg	3150102	Trituração celular
dNPA	Síntese Genemed	N/A	Agonista NPFFR2