Estudando a transmigração de linfócitos através de uma monocamada de células endoteliais microvasculares

Resumo

Fonte: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Análise do Extravasamento de Linfócitos Usando um Modelo In Vitro da Barreira Hematoencefálica Humana. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra uma investigação experimental da transmigração de linfócitos através de um modelo de endotélio de barreira hematoencefálica (BBB). Uma monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMECs) é gerada in vitro, e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contendo linfócitos são adicionadas à monocamada. As células são então incubadas para permitir a transmigração de linfócitos e as células migradas são quantificadas usando citometria de fluxo.

Protocolo

1. Preparação das bulas de cultura celular

1. Revestimento de insertos de cultura celular
   Nota importante: Evite tocar na membrana das inserções de cultura de células.
   1. Adicione 100 μL de solução de fibronectina a cada inserto de cultura de células (Figura 1A) e um poço de uma placa de fundo plano de 96 poços (poço de controle óptico). Incubar durante, pelo menos, 3 h a 37 °C. Após a incubação, aspire a solução de fibronectina.
   2. Adicione 100 μL de suspensão HBMEC às inserções de cultura de células e ao poço de controle óptico. Adicionar 600 μl de meio endotelial de células basais (ECM-b) ao compartimento inferior das inserções de cultura de células. Incubar por 3 a 4 dias a 37 °C / 5% CO₂ até atingir a integridade da barreira (Figura 1B), verificar o crescimento celular por avaliação microscópica do HBMEC no poço de controle óptico.
      nota: O crescimento celular além de quatro dias não é recomendado.

2. Ensaio de migração

1. Preparação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC).
   1. Adicione 10 mL de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 200 μL de suplemento de B27. Conte PBMC e centrifugue as células a 300 x g por 5 min. Ressuspenda o PBMC até uma concentração final de 5 x 10⁶ células/mL RPMI/B27.
2. Configuração do ensaio de migração
   1. Aspirar o meio do compartimento inferior seguido pelo compartimento superior das inserções de cultura celular contendo monocamadas confluentes de HBMEC (Figura 1A). Por doador, adicionar 100 μL de suspensão de PBMC às inserções de cultura de células e também a um poço de uma placa de 24 poços por (controle in vitro).
   2. Adicionar 600 μL de RPMI/B27 ao compartimento inferior das inserções de cultura celular e 500 μL ao PBMC do controlo in vitro e incubar 6 h a 37 °C / 5% CO_2.
3. Coleta de PBMC migrado
   1. Retire o inserto de cultura de células usando uma pinça e enxágue cuidadosamente o fundo com 400 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem tocar na membrana. Descarte o inserto de cultura de células.
   2. Adicione fluoroesferas de contagem de fluxo de 20 μL (aproximadamente 1.000 grânulos / μL) ao compartimento inferior do inserto de cultura de células, bem como ao controle in vitro e misture bem. Transfira 1 mL da suspensão resultante de PBMC para tubos de citometria de fluxo.

3. Citometria de fluxo

1. Preparação da amostra
   1. Centrifugue PBMC a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.
   2. Preparar a solução de anticorpos adicionando anticorpos conjugados com fluorocromo a 100 μL de tampão de citometria de fluxo (PBS/albumina de soro bovino a 1% [BSA]/2 mM de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]) por amostra. Para os resultados apresentados a seguir, foram utilizados 1 μL de CD4-FITC (cluster de diferenciação de isotiocianato de 4-fluoresceína), 1 μL de CD3-PerCP/Cy5.5 (proteína da peridinina-clorofila/cianina 5,5), 1 μL de CD56-PC7 (ficoeritrina cianina 7), 1 μL de CD8-A700 (Alexa fluor 700) e 1 μL de CD16-A750 (Alexa fluor 750), por amostra.
   3. Ressuspenda PBMC em 100 μL da solução de anticorpos e incube por 30 min a 4 °C.
   4. Adicione 250 μL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 300 x g por 5 min.

Resultados

Figura 1: Migração diferencial de subconjuntos de células NK em monocamadas HBMEC não inflamadas e inflamadas. A. Uma imagem de inserções de transwell (esquerda) e ilustração da configuração experimental (direita). B. Validação das funções de barreira HBMEC. Esquerda: coloração imuno-histoquímica da molécula de junção apertada ZO-1 usando zonula occludens-1 humana de coelho (ZO-1, ab...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PBS	Gibco	14190-094	sem CaCl2 ou MgCl2
Fibronectina 1mg/mL	Sigma	Rolamento F1141-5MG	de plasma bovino
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicilina/estreptomicina	ScienCell	1001-b
Suplemento de crescimento de células endoteliais	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	transparente, 6,5 mm de diâmetro, tamanho de poro de 3,0 μm
Placa de fundo plano de 96 poços	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x concentrado
Placa de 48 poços	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Fluoroesferas de contagem de fluxo	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolenda	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolenda	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11