Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Determinação da zona de infarto
- Meça a zona de infarto (IZ) 24 h após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO).
NOTA: Ratos que perderam mais de 20% de seu peso ou desenvolveram convulsões ou hemiplegia são excluídos do experimento.
- Eutanasiar o rato substituindo a mistura de gases inspirados por 20% de oxigênio e 80% de dióxido de carbono até que o rato pare de respirar espontaneamente.
- Abra o tórax com uma incisão lateral de 5-6 cm através da parede abdominal sob a caixa torácica usando uma tesoura e uma pinça cirúrgica.
- Faça uma incisão diafragmática ao longo de todo o comprimento da caixa torácica com tesoura e pinça cirúrgica.
- Deslocando cuidadosamente os pulmões, corte a caixa torácica até a clavícula nos lados direito e esquerdo.
- Perfundir com 200 mL de solução salina normal através do ventrículo esquerdo do coração.
- Perfure ou incise o átrio direito do coração com uma tesoura.
- Realize a decapitação usando uma guilhotina e colete tecido cerebral.
- Usando uma tesoura de íris, corte do forame magno até a borda distal da superfície posterior do crânio em ambos os lados.
- Separe os bulbos olfatórios, as conexões nervosas ao longo da superfície ventral e a superfície dorsal do crânio do cérebro.
- Remova o cérebro da cabeça.
- Produza 6 fatias de cérebro criando seções horizontais de 2 mm de espessura com uma lâmina de barbear de aço inoxidável, sem revestimento e de borda única.
- Incubar durante 30 min a 37 °C em TTC a 0,05%.
- Coloque o tecido cerebral nas lâminas do microscópio e faça a varredura óptica dessas 6 fatias cerebrais com uma resolução de 1600x1600 dpi (consulte Figura 1 por exemplo).
- Adicione um filtro azul com um editor de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop CS2) usando a função Channel Mixer (Image > Adjustments > Channel Mixer) e salve a imagem como um formato de arquivo JPEG.
NOTA: Depois de aplicar o filtro azul, a imagem aparecerá em tons de cinza.
- Abra a imagem salva no ImageJ 1.37v.
NOTA: Este programa de computador usa uma função de limite para isolar e calcular os pixels que são pretos ou brancos (consulte Figura 2).
- Para cada uma das 6 fatias cerebrais da imagem, selecione e salve cada hemisfério (ipsilateral lesionado direito e contralateral esquerdo não lesionado) como um arquivo de imagem separado usando a ferramenta "seleção de polígonos" no menu principal.
- Defina o ponto de corte para determinar o IZ usando uma função de limite automático no menu principal do software ImageJ selecionando Image > Ajustar > Threshold e medir o número de pixels em cada hemisfério de um único conjunto cerebral.
NOTA: Macros podem ser usadas para esta etapa no software ImageJ (consulte Documento suplementar 1 para o código). O corte é um parâmetro crítico para determinar quais pixels converter em branco e quais converter em preto, dependendo do tom de cinza (consulte Figura 3 e Figura 4 como exemplos). O ImageJ então compara pixels brancos e pretos para determinar o IZ. Com base no protocolo de coloração e nas configurações do scanner, usamos um valor de corte constante de 0,220.
- Realize a medição da correção do IZ para inchaço do tecido usando o método Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres (RICH) (veja o exemplo em Figura 5).
NOTA: O tamanho do infarto é avaliado como uma porcentagem do hemisfério contralateral.
2. Determinação do edema cerebral
NOTA: Use ImageJ 1.37v para medição de edema cerebral (BE).
- Meça BE 24 h após o MCAO. Para o cálculo do EB, use os dados do volume do hemisfério esquerdo e direito (em unidades).
- Execute a varredura óptica com uma resolução de 1600x1600 dpi (consulte Figura 1 por exemplo).
- Selecione os hemisférios cerebrais e defina o ponto de corte para determinar o BE com ImageJ 1.37v, conforme descrito acima nas seções 1.17-1.19.
- Expresse a área BE como uma porcentagem das áreas padrão do hemisfério contralateral não afetado, calculada pelo método RICH usando a seguinte equação (veja o exemplo em Figura 5).
NOTA: A extensão do EB é avaliada como uma porcentagem do hemisfério contralateral.
