Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

Resumo

Fonte: Kuzmanov, I., et al. Um modelo in vitro da barreira hematoencefálica usando espectroscopia de impedância: um foco na interação célula-célula endotelial. J. Vis. (2016)

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resistência elétrica transendotelial (TEER) em células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongos in vitro. Um valor TEER alto indica junções de células endoteliais intactas, enquanto a adição de células T ativadas reduz o valor TEER, refletindo a ruptura da barreira juncional.

Protocolo

1. Configurando e realizando a medição da resistência elétrica transendotelial (TEER)

1. Coloque o módulo de 24 poços do instrumento de resistência elétrica transendotelial (TEER) sob a capela de fluxo laminar. Remova as tampas e coloque inserções com células endoteliais microvasculares primárias do cérebro de camundongo (MBMECs) no instrumento usando uma pinça.
2. Pipetar 810 μl de meio fresco para o compartimento inferior dos poços do módulo: adicione-o cuidadosamente entre o inserto e a parede do compartimento do módulo.
3. Feche as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao computador; Ligue o controlador do instrumento e abra o software.
4. Selecione 'nova medição' na janela pop-up. Marque as caixas 'mostrar TEER' e 'mostrar Ccl'; Em seguida, pressione 'iniciar'. Depois de concluir a primeira medição, selecione 'verificar todos os poços' na guia 'resultados' para ver todos os valores de TEER e capacitância da camada celular (Ccl).
5. Salve o arquivo: File>Save as>' o nome do seu arquivo'.
   NOTA: Como TEER e Ccl são medidos continuamente de forma automatizada, monitore seus valores por um período de três a cinco dias. A mudança do meio não é necessária, a menos que a viabilidade celular seja abaixo do ideal, como visualizado pela falta de aumento no TEER.
6. Escolha o ponto de tempo para co-cultivar MBMECs com células T quando Ccl estiver estável e inferior a 1 μF/cm² e TEER atingir seu nível máximo.
7. Inspecione cuidadosamente os valores absolutos de TEER e Ccl e exclua os poços nos quais os MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes o suficiente, desmarcando esses poços.
8. Agrupe o resto dos poços: clique com o botão direito do mouse em um poço e selecione 'adicionar poço ao novo poço médio'. Nomeie-o na janela pop-up; Faça o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados.
9. Verifique todos os poços médios para confirmar se todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Se alguns tiverem valores absolutos de TEER ou inclinações de TEER significativamente diferentes, ou se os erros padrão forem muito grandes, refaça o agrupamento.
   NOTA: O agrupamento ideal de poços fornece variação mínima nos valores de TEER dentro e entre os grupos experimentais.
10. Na guia 'experimento', pressione 'pausa', desconecte o instrumento e retire-o da incubadora. Remova as tampas sob a coifa de fluxo laminar.
11. Prepare células T pré-ativadas e/ou virgens, com ou sem citocinas, anticorpos ou outras substâncias específicas, conforme desejado. Por exemplo, misture o anticorpo antiferon-gama-interferon-gama-camundongo (IFN-γ) de rato nativo/baixo endotoxina purificado (NA/LE) (clone XGM1.2) com células T preparadas a 20 μg/ml por poço do instrumento TEER.
    NOTA: Se substâncias como o inibidor da granzima B forem usadas, elas são adicionadas à cultura de células T no início da estimulação das células T: , por exemplo, , o inibidor de Granzima B II (Calbiochem) é misturado com células T isoladas a uma concentração final de 10 μM em dimetilsulfóxido (DMSO).
12. Remova parte da mídia do inserto (o compartimento do poço superior). Exemplo: pipetar cuidadosamente 150 μl (deve-se evitar remover todo o meio, pois pode perturbar a monocamada de MBMEC).
13. Adicione células T aos MBMECs pipetando cuidadosamente 150 μl de meio contendo 2 x 10 ⁵ células / inserção.
    NOTA: Ao coletar células T pré-ativadas, conte apenas as células livres de azul de tripano.
14. Feche as tampas e coloque o instrumento de volta na incubadora. Reconecte o instrumento e pressione 'retomar medição'. Após 24 horas, pressione 'parar' na guia 'experimento' e salve o arquivo (File>Save).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	incluindo: Módulo de célula de 24 poços, controlador, PC com software cellZscope v2.2.2
Inserções de membrana Transwell - tamanho de poro 0,4 μm	Corning	3470	para medição TEER como leitura principal
Inserções de membrana Transwell - tamanho do poro 3 μm	Corning	3472	para medição TEER como controle de qualidade antes do ensaio de transmigração de células T
Placa de cultura de células de 24 poços	Greiner	650 180	fundo plano; para a cultura MBMEC
Placa de cultura de células de 96 poços	Costar	3526	fundo redondo; para cultura de células imunes
Câmara de contagem de Neubauer	Marienfeld	MF-0640010	para contagem de células
Colágeno tipo IV da placenta humana	Sigma	C5533	para solução de revestimento MBMEC
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141-5MG	para solução de revestimento MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC
Penicilina/estreptomicina	Sigma	Pág. 4333	para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC
Heparina	Sigma	H3393	para meio de cultura MBMEC
Fator de Crescimento de Fibroblastos Básicos Humanos (bFGF)	PeproTech	100-18B	para meio de cultura MBMEC
IMDM + 1% de L-glutamina	Gibco	21980-032	para meio de cultura de células T
IFN-γ	PeproTech	315-05	para ensaios de transmigração de células T
TNF-α	PeproTech	315-01A	para ensaios de transmigração de células T
Anticorpo anti-IFN-γ purificado com NA/LE	BD Biociências	554408	clone XMG1.2; Concentração final recomendada: 20 μg/ml
Inibidor de Granzima B II	Calbiochem	368055	concentração final recomendada: 10 μM
Anticorpo CD4 anti-camundongo PE	Biolenda	116005	clone RM4-4; para análise da transmigração de células T
Solução de azul de tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	para contagem de células

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