Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Perfusão e processamento de tecidos
- Anestesiar camundongos usando uma injeção intraperitoneal com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Aperte os dedos dos pés para confirmar a falta de resposta antes de continuar.
- Perfundir transcardialmente com ~50 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) gelada seguida de paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão fosfato 0,1M (PB).
CUIDADO: PFA é tóxico. Use equipamento de proteção individual (EPI) ao trabalhar com PFA.
- Remova os cérebros e mergulhe-os em 4% de PFA em 0,1 M PB a 4 ° C por 24 h para pós-fixação. Lave com DPBS 3x.
- Mude para solução de sacarose a 15% em 0,1 DPBS durante a noite e, em seguida, solução de sacarose a 30% em 0,1 M DPBS por mais 48 h a 4 ° C.
- Retirar o tecido da solução de sacarose e congelar numa câmara criotómica pré-ajustada a uma temperatura de -20 °C. As amostras congeladas podem ser armazenadas em tubos selados a -80 °C até à secção.
- Incorpore os tecidos em meio de inclusão de temperatura de corte ideal (consulte a Tabela de Materiais) e monte em um disco de amostra. Corte seções seriais de 30 μm de espessura em um plano coronal usando um criótomo e colete todas as seções consequentemente em placas de cultura de 24 poços preenchidas com solução crioprotetora (30% de glicerol, 30% de etilenoglicol, 40% de DPBS; Figura 1A-C). Armazenar em freezer a -20 °C.
NOTA: Seções mais espessas (por exemplo, 50 μm) são preferíveis quando viável. Certifique-se de que as seções sejam mantidas em ordem de corte e que todas as seções estejam completamente em crioprotetor. Uma placa de 96 poços pode ser usada como alternativa às placas de 24 poços para coletar seções.
- Cubra os poços com selador de placas para evitar evaporação e secagem. Armazene os pratos a -20 °C até uso posterior. As seções armazenadas a -20 ° C são estáveis por vários meses para a imuno-histoquímica da colina acetiltransferase (ChAT).
2. Seleção sistemática de seções para IHQ
NOTA: Um estudo piloto deve ser feito para saber o número total de seções necessárias para atingir um coeficiente de erro (CE) aceitável. O valor CE é uma expressão da quantidade total de erro no procedimento de amostragem. O valor mais baixo representa o erro mínimo, e um valor CE inferior a 0,1 é considerado aceitável pelo software usado aqui (consulte a Tabela de Materiais).
- Identifique a primeira e a última seções de cada cérebro comparando características morfológicas com um atlas cerebral de camundongo padrão, como Franklin e Paxinos. O núcleo basal de Meynert ou NBM começa em bregma -0,0 mm e termina em -1,6 mm. Portanto, cerca de 50 seções contêm NBM. O número total de seções é um dos parâmetros necessários durante a estereologia. A seleção de cada8ª seção (SSF = 1/8) deu um total de 6 a 7 seções para a análise e produziu um CE aceitável tanto para estimativa de volume quanto para estimativa de comprimento de fibra em nosso estudo piloto.
- Comece aleatoriamente com uma das oito primeiras seções e, em seguida, aponte sistemicamente a cada8ª seção até a última seção posterior contendo NBM (Figura 1C).
3. Imuno-histoquímica
- Transfira as seções criopreservadas para a temperatura ambiente em crioprotetor e, em seguida, tampão fosfato 0,1M (PB) em placas de 6 poços.
- Lave 3x em PB.
- Incubar em 0,3% H2O2 em metanol por 15 min.
- Lave 3x em solução salina tamponada com Tris (TBS).
- Incube em 0,25% de Triton X-100 em TBS por 30 min.
- Bloqueio com 10% de soro bovino normal (NBS) em Triton X-100 a 0,1% em TBS por 30 min.
- Incubar com uma diluição de 1:1.000 de anticorpos primários anti-ChAT humano de cabra (ver Tabela de Materiais) em TBS com 0,1% de Triton X-100 e 1% de NBS por 48 h a 4 °C.
- Lave 3x em TBS em temperatura ambiente. Realize todas as incubações e lavagens posteriores à temperatura ambiente.
- Incubar com anticorpo secundário anti-caprino bovino biotinilado (ver Tabela de Materiais) por 1 h.
- Lave 3x em TBS.
- Incubar com o complexo avidina-biotina-peroxidase (ver Tabela de Materiais).
- Lave 3x em TBS.
- Desenvolver usando uma solução aprimorada de substrato de peroxidase DAB (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.
CUIDADO: DAB é suspeito de ser cancerígeno. É tóxico por contato e inalação. Use EPI ao trabalhar com DAB.
- Lave a seção algumas vezes com água destilada e mantenha em Tris pH = 7,6.
- Monte as seções nas lâminas gelatinizadas. Todas as seções de um tecido podem ser colocadas na mesma lâmina. Seque as seções ao ar, desidrate 2x por 5 min cada com 70%, 90%, 95% e 100% de etanol e, em seguida, limpe as seções com duas lavagens de xileno de 10 min. Aplique lamínula nas seções usando um meio de montagem (consulte Tabela de Materiais).
NOTA: O tempo de processamento de desidratação e limpeza afeta a espessura das seções. Portanto, as mesmas condições devem ser usadas para todas as seções. No presente estudo, o valor médio da espessura final foi de 21,11 ± 0,45 μm.
- Manter as secções do exaustor a secar. As seções secas estão prontas para a estereologia.
