$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Captação de dopamina sinaptossomal
NOTA: Este protocolo é para avaliação paralela de dois cérebros, mas também pode ser usado com sucesso para realizar experimentos de captação de dopamina sinaptossomal (DA) com quatro cérebros em paralelo.
- preparações
- Rotule 48 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL de acordo com a Tabela 1 (24 para cada cérebro). Use cores diferentes para os tubos pertencentes a cada cérebro para evitar confusão entre as amostras.
- Rotule 51 tubos de cintilação #1-51.
- Coloque a solução salina tamponada com fosfato (PBS) no gelo. Isso será usado para manter os cérebros resfriados.
- Ligue a centrífuga para permitir que ela pré-esfrie a 4 °C.
- Pesar previamente dois tubos de microcentrífuga para obter o peso exato do tecido durante a preparação sinaptossomal (secção 2.6).
- Prepare o tampão de homogeneização misturando HEPES 4 mM e sacarose 0,32 M. Ajuste o pH para 7,4 e mantenha no gelo.
nota: O tampão de homogeneização pode ser mantido em alíquotas a -20 °C e descongelado no dia do experimento.
- Prepare o tampão de captação combinando o seguinte: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM de ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM de D-glicose (0,991 g/L). Ajuste o pH para 7,4 com NaOH (leva a uma concentração de sódio de aproximadamente 130 mM) e mantenha no gelo.
nota: Para 2 cérebros, prepare 1500 mL de tampão de captação. Prepare o tampão de captação como uma solução de estoque 10x sem ácido ascórbico e glicose mantida a 4 ° C. Faça 1x solução de trabalho na hora no dia, suplementando com ácido ascórbico e glicose. Ajuste o pH com NaOH para 7,4.
- Prepare o tampão de captação + ligante combinando o seguinte: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM de ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM de D-glicose (0,991 g/L), 1 μM de pargirina, 100 nM de desipramina, 10 nM de inibidor da catecol-O-metil-transferase (COMT). Ajuste para pH 7,4 com NaOH e mantenha no gelo.
nota: Use tampão de captação de 50 mL e adicione ligante. Pargyline é adicionado para ajudar a prevenir a degradação do DA por oxidação através da monoamina oxidase (MAO). O inibidor da COMT (RO-41-0960) é adicionado para prevenir a degradação da DA (catecolaminas em geral) através da COMT. A desipramina é adicionada para inibir a captação através dos transportadores de norepinefrina e serotonina e, assim, tornar os resultados de captação específicos para o transportador de dopamina (DAT).
- Prepare o tampão de captação + ligante + cocaína (coc) combinando o seguinte: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1 mM de ácido ascórbico (0.194 g/L), 5 mM de D-glicose (0.991 g/L), 1 μM de pargílina, 100 nM de desipramina, 10 nM de inibidor de COMT, 500 μM de cocaína. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH e mantenha no gelo.
nota: Use 7 mL de tampão de captação + ligante e adicione cocaína. A cocaína é adicionada para obter uma medição de fundo da captação não específica de DA para subtrair dos dados, deixando apenas a captação específica de AT (uma vez que SERT e NET são inibidos pela desipramina, conforme descrito acima). Alternativamente, um inibidor de DAT altamente potente e específico, GBR-12935, pode ser usado em seu lugar.
Importante: Mantenha tudo no gelo a partir de agora.
- Preparação sinaptossômica
- Sacrifique um rato de cada vez por luxação cervical e decapitação.
- Corte a pele usando uma tesoura para revelar o crânio e corte qualquer excesso de tecido posterior do crânio deixado pela decapitação. Corte o crânio com uma pequena tesoura reta ao longo da sutura sagital, terminando o mais anteriormente possível.
- Coloque as duas pontas de tesoura em cada olho do rato e corte o crânio para remover o restante do crânio e o cérebro intacto. Remova rapidamente o cérebro e coloque-o em PBS gelado. Isso o manterá frio enquanto o segundo cérebro é dissecado.
- Usando uma matriz cerebral, disseque um corte coronal de 3 mm do estriado (ântero-posterior: +1,5 mm a -1,5 mm), seguido de uma dissecção mais fina com um perfurador. Consulte a Figura 1 para ver a área de perfuração.
- Mantenha o tecido no gelo o tempo todo, avançando.
- Transfira o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para pesagem.
nota: Este peso será utilizado no passo 1.2.14.
- Repita as etapas 1.2.1-1.2.6 para o segundo cérebro.
- Uma vez obtido o peso para ambos os cérebros, transfira o tecido para um copo de homogeneização contendo 1 mL de tampão de homogeneização gelado.
- Homogeneizar o tecido usando um pilão motorizado a 800 rpm, 10 golpes pares.
nota: Um golpe equivale a uma ação para cima e para baixo. O primeiro golpe deve ser de cerca de 5 s, os 3-4 s seguintes. A homogeneização em meio isotônico é importante para evitar o rompimento dos sinaptossomos. O uso de força e meio isotônico apropriados permitirá que os terminais pré-sinápticos selem novamente o citoplasma, as vesículas sinápticas, as mitocôndrias e o citoesqueleto.
- Transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colete o homogeneizado restante do vidro de homogeneização, enxaguando-o com 0,5 mL de tampão de homogeneização adicional.
- Mantenha a amostra no gelo enquanto o tecido do outro cérebro é homogeneizado. Execute os dois cérebros em paralelo nas etapas 1.2.12-1.2.13.
- Pelotizar os núcleos e os restos celulares por centrifugação (1.000 x g, 10 min, 4°C).
- Transfira o sobrenadante (S1) (contendo membranas celulares e citoplasma) para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Rejeitar o sobrenadante (contendo citoplasma) e ressuspender o sedimento (P2) (contendo sinaptossomas brutos) em 40 μL de tampão de homogeneização/mg de tecido (com base no peso obtido no passo 1.2.6). Ressuspenda suavemente a fração sinaptossomal bruta com uma pipeta p1000, pois muita força quebrará os sinaptossomos.
nota: É importante terminar com pelo menos 280 μL. Caso contrário, será necessária uma diluição com mais de 40 μL por mg. As etapas 1.2.1-1.2.13 devem ser executadas o mais rápido possível e tudo deve ser mantido no gelo. Assim que os sinaptossomos brutos são ressuspensos no tampão de homogeneização, eles são bastante estáveis enquanto são mantidos no gelo.
2. Experiência de Absorção
- Adicione 440 μL de tampão de captação + ligante + cocaína aos 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL designados e 440 μL de tampão de captação + ligante aos 36 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL restantes (consulte a Tabela 1 para o layout).
nota: Remova-os do gelo 15 minutos antes do início do experimento para trazê-los à temperatura ambiente, mas mantenha no gelo até então para conservar os inibidores.
- Prepare a curva de saturação (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) em várias concentrações finais (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0 μM)).
- Rotule seis tubos de microcentrífuga de 2 mL como 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 e 0.31.
- Adicione 750 μL de tampão de captação + ligante aos 5 tubos de microcentrífuga com o menor número.
- Adicione 1.455,4 μL de tampão de captação + ligante, 14,6 μL de dopamina (1 mM), 30 μl de dopamina 3-H (11 μM) ao tubo rotulado com 10.
- Transfira 750 μL do tubo identificado como 10 para o tubo identificado como 5. Misture bem e transfira 750 μL deste tubo para o tubo 2,5. Repita esta diluição com os tubos restantes.
- Enxágue previamente os filtros de microfibra de vidro com tampão de absorção de 4 mL depois de colocá-los em um balde de filtro de 12 poços.
- Adicione 10 μL da suspensão de membrana sinaptossomal aos primeiros 24 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (consulte a Tabela 1 para o layout) contendo 440 μL de tampão. Vortex com cuidado e gire para baixo brevemente para garantir que os sinaptossomos estejam submersos no tampão. Deixe a 37 oC por 10 min.
nota: É importante ser exato nos tempos durante o experimento de captação para uma comparação justa entre os cérebros. Use um cronômetro para precisão.
- Adicionar 50 μL de dopamina nas concentrações de 10 e 5 μM (secção 2.2) às duas primeiras colunas e deixar a 37 oC durante 5 min com agitação. Após exatamente 5 min, pare a reação adicionando 1 mL de tampão de captação gelada. Faça o mesmo com as concentrações de 2,5 e 1,25 μM (seção 2.2) e depois com as concentrações de 0,62 e 0,31 μM.
- Adicione as amostras aos filtros de microfibra pré-enxaguados e lave com 5 x 4 mL de tampão de absorção gelada. Quando as primeiras 12 amostras tiverem sido adicionadas aos filtros, mova os filtros para tubos de cintilação. Repita isso com as próximas 12 amostras.
- Repita as etapas 2.4-2.6 para o próximo cérebro.
- Prepare 3 tubos de contagem máxima colocando um filtro de microfibra no fundo dos tubos de cintilação 49-51 e adicionando 25 μL da concentração máxima de dopamina no topo (10 μM).
- Deixar os 51 tubos de cintilação numa hotte durante 1 h.
- Adicione 3 mL de fluido de cintilação a cada tubo de cintilação e agite vigorosamente em um shaker por 1 h.
- Conte [3H]-DA em um contador beta por 1 min.
- Abra o programa e escolha: Rótulo: H-3, Placa/Filtro: Frasco de 4 mL, 4 por 6, Tipo de ensaio: Normal e Tempo de contagem: 1 min.
nota: Esta etapa pode ser realizada no dia seguinte, se for mais conveniente. Deixe as amostras cobertas com papel alumínio durante a noite.
- Determinação de proteínas
- Use um kit padrão de ensaio de proteína BCA para determinar as concentrações de proteína dos sinaptossomos para ajustes de contagens por minuto (cpm) para fmol/min/μg e para comparação adequada da absorção entre amostras.
3. Análise dos dados
- Use os dados do experimento de captação para fazer uma curva de saturação para cada grupo e calcular a taxa da reação (Vmax) e a constante de Michaelis Menten (KM).
nota: O valor KM reflete a concentração de substrato necessária para atingir metade de Vmáx. Assim, Vmax reflete diretamente a função de DAT (capacidade máxima de captação), que depende do número de DAT na superfície e de como sua atividade pode ser modulada por modificações pós-traducionais e / ou proteínas interagentes, bem como por alterações nos gradientes iônicos. O valor KM é uma medida indireta da afinidade do substrato para o transportador que, o que é importante, também pode ser modulado por modificações pós-traducionais e/ou proteínas interagentes. Para avaliar completamente as alterações funcionais, é importante determinar diretamente os níveis de expressão de superfície por, por exemplo, um ensaio de biotinilação de superfície.
Tabela 1: Layout do tubo de microcentrífuga para preparação sinaptossômica.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10+coc | 5+coc | 2.5+coc | 1.25+coc | 0.62+coc | 0.31+coc |
