Marcação de interneurônios preenchidos com biocitina em fatias de hipocampo de rato para visualização

Resumo

Fonte: Economides, G., et al. Recuperação de biocitina e reconstruções 3D de interneurônios CA2 do hipocampo preenchidos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir fatias fixas de cérebro de rato contendo interneurônios cheios de biocitina. O protocolo inclui incubação com complexo avidina-biotina (ABC), coloração com HRP e substrato cromogênico, preservação de estruturas com tetróxido de ósmio e incorporação do tecido em resina para imagem.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado

1. Determinação da proteína de ligação ao cálcio ou do conteúdo proteico dos interneurônios e visualização da biocitina após registros eletrofisiológicos e preenchimento de biocitina

Nota: Ao final dos registros eletrofisiológicos, as fatias que contêm células preenchidas com biocitina são fixadas durante a noite antes dos procedimentos histológicos. A solução fixadora será substituída por uma única troca de tampão fosfato 0,1 M na manhã seguinte se o restante do procedimento for realizado em outro dia, a fim de evitar danos aos tecidos. A solução de fixação (paraformaldeído a 4%, solução saturada de ácido pícrico a 0,2%, solução de glutaraldeído a 0,025% em tampão fosfato 0,1 M (PB)) deve ser feita fresca no dia das gravações para obter melhores resultados.

1. Ao final do registro eletrofisiológico, pegue cuidadosamente a fatia contendo a(s) célula(s) registrada(s) com um pincel e coloque-a em um pote contendo líquido cefalorraquidiano artificial (CSAP).
   nota: Detalhes do protocolo usado para preparo de cortes e registros intracelulares usando eletrodos cortantes foram descritos anteriormente.
2. Em uma capela de exaustão, pegue cuidadosamente a fatia do cérebro com um pincel e enrole-a em um pequeno pedaço de papel de filtro de boa qualidade. Coloque outro pedaço de papel de filtro umedecido na fatia e coloque os dois pedaços de papel de filtro úmido em um pequeno pote de plástico contendo 5-10 mL de solução fixadora e guarde na geladeira durante a noite a 4 °C.
3. Prepare uma solução de gelatina em água destilada. Coloque 20 ml de água destilada num copo numa placa quente e aqueça a 60 °C. Adicione progressivamente 2,4 g de gelatina à água, espere dissolver e deixe arrefecer até 35-40 °C antes de utilizar para evitar danos nos tecidos.
4. Substitua a solução fixadora por 2 mL de 0,1 M PB. Coloque a fatia em uma placa de Petri e corte o excesso de tecido com uma lâmina de bisturi. Coloque o tecido aparado em uma placa de Petri (diâmetro de 9 cm, altura de 1,4 cm), certificando-se de que fique plano, sem dobras ou vincos, e remova o excesso de tampão usando um pincel seco.
5. Cubra o tecido com a solução de gelatina quente e coloque a placa de Petri em um bloco congelado para resfriar rapidamente a solução.
6. Usando uma lâmpada de equilíbrio angular para fornecer contraste, olhe pela lateral do prato e mantenha a fatia plana usando uma leve pressão de um pincel fino até que a gelatina comece a endurecer.
   nota: A gelatina pode ser derretida novamente se o tecido não ficar plano. Quaisquer imperfeições na superfície da gelatina causadas pela remoção do pincel à medida que ela se solidifica podem ser removidas derretendo suavemente a camada superficial, movendo o bulbo da lâmpada para perto da superfície por alguns segundos.
7. Leve o prato de gelatina para o frigorífico e deixe a 4 °C durante 30-60 min.
8. Em uma hotte, corte um pequeno bloco (~ 1 x 1 cm) contendo o tecido embebido em gelatina do prato usando uma lâmina de bisturi, levante o bloco usando uma pequena espátula e coloque-o cuidadosamente na mesma solução fixadora fresca usada para fixar as fatias por pelo menos 30 min a 4 °C.
9. Lave o bloco de gelatina em 5 mL de 0,1 M PB três vezes, seque-o com um pedaço de papel de papel e cole o lado do bloco para cima (ou seja, com o tecido na parte superior) em um mandril de vibratomo usando super cola.
10. Remova o excesso de cola com um pedaço de papel de filtro e use uma lâmina de bisturi para cortar os cantos do bloco, deixando uma forma de diamante.
11. Corte a fatia com 50 μm de espessura usando um vibratomo e coloque cada seção cuidadosamente em um frasco de vidro contendo 10% de sacarose.
12. Pegue cuidadosamente uma seção do frasco e coloque-a plana na tampa de uma placa de Petri. Usando um microscópio de dissecação e uma lâmina de bisturi fresca, remova a gelatina ao redor da seção e retorne a seção a um frasco contendo 2 mL de sacarose fresca a 10%
    nota: É crucial remover o máximo de gelatina possível nesta fase para reduzir o encolhimento do tecido durante a etapa de desidratação (Etapa 1.37).
13. Crioproteja as seções em solução de sacarose-glicerol à base de PB 0,1 M à temperatura ambiente, incubando-as por 10 min em solução de sacarose a 10%, 20 min em solução de sacarose a 6% de sacarose a 20% duas vezes e, finalmente, 30 min em solução de sacarose a 30% e glicerol a 12% duas vezes sob agitação constante.
14. Coloque as seções planas em um pequeno retângulo de papel alumínio usando um pincel. Remova o excesso de líquido das seções e dobre cuidadosamente o papel alumínio em um pacote.
15. Segure o pacote próximo à superfície do nitrogênio líquido sem tocar na superfície por 30 s e, em seguida, deixe as seções descongelarem completamente por aproximadamente 30 s. Repita o congelamento e descongelamento mais duas vezes.
16. Remova todas as seções com um pincel e coloque-as em um frasco de vidro contendo 2 mL de 0,1 M PB sob agitação constante para lavar o excesso de sacarose.
17. Remova o PB com uma pipeta Pasteur e incube as seções em 2 mL de peróxido de hidrogênio aquoso a 1% (H₂O₂) por 30 min. Lave as seções em 2 mL de 0,1 M PB 3x 5 min.
18. Remover o PB 0,1 M com uma pipeta Pasteur e adicionar borohidreto de sódio a 1% (NaBH₄) em 0,1 M PB.
    nota: Não tampe o frasco, pois a solução de NaBH₄ libera gás hidrogênio.
19. Remova o borohidreto de sódio com uma pipeta Pasteur e lave bem as seções em 2 mL de 0,1 M PB 5x 5 min.
20. Substitua o PB 0,1 M por soro de cabra normal (NGS) a 10% em PB 0,1 M por 30 min.
21. Retirar o soro caprino e incubar os cortes durante a noite a 4 °C em uma mistura de anticorpos monoclonais de camundongo e policlonais de coelho confeccionados em solução ABC.
    nota: Uma lista de anticorpos primários usados em estudos anteriores é exibida na Tabela 1.
22. Incube as seções por 2 h no escuro em uma mistura de anticorpos secundários marcados com fluorescência (Tabela de Materiais).
23. Monte as seções nas corrediças em meio de montagem e cubra-as com uma lamínula.
24. Tire imagens da marcação de fluorescência com ampliação de 40X (Figura 1Bb).
25. Após a imagem de fluorescência, coloque a lâmina em uma placa de Petri de vidro contendo PBS e remova cuidadosamente a lamínula. Em seguida, lave as seções da lâmina usando pulsos suaves de PBS de uma pipeta Pasteur. Coloque as secções num frasco de vidro limpo contendo PBS.
26. Realize a reação avidina-HRP incubando primeiro as seções em ABC por pelo menos 2 h para amplificar o produto da reação HRP.
27. Prepare a solução de 3,5 diaminobenzidina (DAB) adicionando um comprimido a 5 ml de água destilada.
28. Lave as seções com PBS três vezes por 10 min e depois com tampão Tris duas vezes por 10 min. Remova o tampão Tris após a última lavagem.
29. Adicione rapidamente uma gota de solução de NiCl₂ (cloreto de níquel) a 8% à solução DAB, pipete a solução para dentro e para fora para misturar e adicione rapidamente 1 mL desta solução sobre as seções. Incubar as secções na solução DAB/NiCl₂ durante 15 min.
30. Adicione 10 μL de 1% H₂O₂ à solução DAB. Deixe a reação prosseguir no escuro sob agitação constante por cerca de 1 a 2 minutos e monitore a marcação das células preenchidas com um microscópio de dissecação.
31. Pare a reação removendo a solução DAB / NiCl₂ / H₂O₂ e lave as seções com tampão Tris duas vezes por 5 min.
32. Em uma capela de exaustão, coloque um pequeno círculo de papel de filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com 0,1 M PB. Levante as secções uma de cada vez do frasco de vidro com um pincel e coloque-as cuidadosamente sobre o papel.
33. Cubra as seções com outro círculo umedecido de papel de filtro e remova o excesso de tampão tocando suavemente o lenço de papel na superfície.
34. Aplique 8–9 gotas de tetróxido de ósmio a 1% em 0,1 M PB no papel superior, cubra o prato e retenha na capela por pelo menos 30 min, mas não mais do que 1 h.
35. Abra a placa de Petri e levante o papel de filtro superior. Levante as seções cuidadosamente, uma de cada vez, com um pincel, coloque-as em um frasco de vidro e enxágue-as em água destilada duas vezes.
36. Descarte os resíduos de tetróxido de ósmio adequadamente. Enxágue todos os equipamentos descartáveis e coloque-os em lixeiras apropriadas.
37. Coloque cada seção plana em uma lâmina de vidro e cubra as seções. Transfira a lâmina para uma placa de Petri, coloque um frasco de vidro vazio sobre a lamínula para mantê-la no lugar e cubra com 50% de álcool. Após 15 min, remova a lâmina da solução e remova as seções da lâmina. Coloque as seções de volta no slide e, em seguida, coloque o slide em álcool 70% por 15 min. Repita o mesmo processo com solução alcoólica a 95% e, finalmente, 100%.
38. Após a etapa de desidratação, transfira as seções para um frasco de vidro contendo álcool 100% em um shaker em uma hotte. Substitua a solução alcoólica por óxido de propileno (C₃H₆O) e lave três vezes por 5 min. Após a última lavagem, mantenha ~ 2 mL de óxido de propileno no frasco para injetáveis e adicione resina (proporção de 1:1). Certifique-se de que a resina esteja dissolvida e mantenha as seções sob agitação constante por 30 min.
39. Coloque cada seção em uma prancheta de alumínio contendo resina epóxi usando uma vara de madeira e incube durante a noite.
    NOTA: Não deixe as seções na resina por mais de 24 h para evitar o risco de danificá-las.
40. Coloque a prancheta sobre uma chapa quente por aproximadamente 10 min. Pegue cada seção com uma vara de madeira e coloque-as em uma lâmina limpa. Mantenha a orientação de cada seção consistente usando um microscópio de dissecação. Coloque uma lamínula sobre as seções. Coloque a lâmina no forno por 48 h a 56 °C para curar.

Tabela 1: Tabela de soluções.

Soluções utilizadas	Composição/Instruções
Solução de fixação	paraformaldeído a 4%, solução saturada de ácido pícrico a 0,2%, solução de glutaraldeído a 0,025% em tampão fosfato (PB) 0,1 M
tampão de fosfato 0,1 M pH 7,6	Adicione 100 mL de tampão de fosfato 1 M a 900 mL de água destilada
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4/7,5	Adicione 10 mL de tampão fosfato 0,1M, 0,2 g de KCl e 8,76 g de NaCl a 990 mL de água destilada
Tampão TRIS pH 7,5	Dissolva 5,72 g de cloridrato de Tris e 1,66 g de base de Tris em 50 mL de água destilada. Em seguida, completar o volume de 1 L com água destilada.
Solução fixadora tamponada de glutaraldeído e paraformaldeído	Paraformaldeído a 4%, solução saturada de ácido pícrico a 0,2%, solução de glutaraldeído a 0,025% em tampão fosfato 0,1 M.
Solução ABC	Solução a ser feita pelo menos 30 minutos antes do uso do kit ABC. Adicione 1 gota da solução A e 1 gota da solução B a 2,5 ml de PBS.
Resina epóxi Durcupan:	Para fazer 20 potes: 20 g do componente A, 20 g do componente B, 0,6 g do componente C e 0,4 g do componente D-
	Proteja a balança contra derramamentos cobrindo a placa com um círculo de papel de filtro. Pesar cuidadosamente os reagentes para um copo tripour nas proporções acima indicadas. Misture bem, mexendo vigorosamente com dois palitos de madeira por pelo menos 5 min. A mistura deve adquirir uma densidade uniforme de cor marrom escuro. Coloque o copo no forno a ~50 °C por no máximo 10 min para remover o maior número possível de bolhas de ar. nota: A resina começará a curar se você deixar o copo no forno por mais de 10 min. Transvase a resina para potes de plástico ou seringas de 5 ml, coloque a data e guarde-as no congelador a -20 °C, prontas a serem utilizadas.

Resultados

Figura 1: Reconstruções neuronais de dois tipos de células em cesta registradas e preenchidas na região CA2 do hipocampo e dados eletrofisiológicos correlacionados obtidos após gravações intracelulares in vitro. Esta figura foi modificada em relação a estudos anteriores. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo Avidin-7-amino-4-metilcumarina-3-ácido acético (Avidin-AMCA) - 20,8 mg/mL	Laboratórios de vetores	A2008
Biocitina ≥98% (TLC)	sigma	B4261
3,5 comprimido de diaminobenzidina (DAB), Para preparar 5 mL	sigma	D4293
Resina epóxi A Durcupan	sigma	Rolamento 44611
Resina epóxi B Durcupan	sigma	Nº 44612
Resina epóxi C Durcupan	sigma	Rolamento 44613
Resina epóxi Durcupan D	sigma	Rolamento 44614
Etanol, puriss. p.a., absoluto, ≥99,8%	sigma	Rolamento 32221
gelatina	sigma	Rolamento 48723
Solução de glutaraldeído, grau I, 25 % em H2O	sigma	G5882
Glicerol, ≥99%	sigma	G5516
Soro de cabra	sigma	G9023
Isotiocianato de fluoresceína anti-camundongo de cabra (FITC) - 14,3 mg / mL	sigma	F2653
Cabra anti-coelho Texas Red (TR)- 3,3 mg/mL	Invitrogen	T2767
Peróxido de hidrogênio, solução a 30%	sigma	H-1009
Óleo de imersão, viscosidade 1.250 cSt (lit.)	sigma	I0890
Cloreto de níquel	sigma	N5756
Tetróxido de ósmio, para microscopia eletrônica, 4% em água	sigma	Rolamento 75632
Paraformaldeído, grau reagente, cristalino	sigma	Pág. 6148
Ácido pícrico, umedecido com água, ≥98%	sigma	197378
Tampão fosfato 1 M	sigma	Pág. 3619
Óxido de propileno, 99%	Alfa Aesar	Rolamento 30765
Tetrahidroborato de sódio	VWR	Rolamento 27885.134
sacarose	Fisher científico	S/8600/53
Cloridrato de Trizma, ≥99,0%	sigma	T5941
Base Trizma, ≥99,9%	sigma	T6066
Meio de Montagem Antidesbotamento Vectashield, , índice de refração 1.45	Laboratórios de vetores	H-1000
Kit Vectastain Elite ABC HRP	Laboratórios de vetores	PK6100
Equipamento usado
Vibratomo	Agar Científico
C4A Pranchetas de alumínio em forma de concha	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Microscópio Leica DMR	Leica Microsystems
Fonte de luz de fluorescência X-Cite 120PC Q	Excelitas Technologies
Câmera digital do microscópio de Leica DFC450	Leica Microsystems
Caneta de desenho técnico Rapidograph 0,18 mm	Centro gráfico de Londres
ponta do rapidograph de 0.18mm	Centro gráfico de Londres
Caneta de desenho técnico Rapidograph 0,25 mm	Centro gráfico de Londres
ponta do rapidograph de 0.25mm	Centro gráfico de Londres
Sistema Neurolucida incluindo estação de trabalho PC, palco, câmera e joystic para controle de palco XYZ	Biociência de Microbrighfield (MBF)
Software Neurolucida versão 2017	Biociência de Microbrighfield (MBF)
Suíte de gráficos CorelDRAW X5	Corel
Software de edição de vídeo	Adobe Premiere Pro
Frascos de vidro 14 mL	Fisher científico