Avaliação do comprometimento motor em modelos de C. elegans usando o ensaio de locomoção radial

Resumo

Fonte: Currey, H. N., et al. Avaliação do Comprometimento Motor em C. elegans Modelos de Esclerose Lateral Amiotrófica. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra o uso de um ensaio de locomoção radial para avaliar a disfunção motora em C. elegans expressando a proteína TDP-43 humana do tipo selvagem ou mutante da ALS. Vermes com níveis variados de expressão de TDP-43 do tipo selvagem ou mutante podem rastejar, e seu movimento é medido pela distância radial percorrida a partir do ponto central na placa de ensaio. O ensaio distingue entre deficiências motoras leves, moderadas e graves com base na distância percorrida pelas diferentes cepas de C. elegans.

Protocolo

1. Ensaio de locomoção radial

1. Prepare placas de Petri de 100 mm ou 150 mm de diâmetro, cerca de metade cheias de meio de crescimento de nematóides (NGM) e semeadas com um gramado uniforme de bactérias OP50 para cobrir toda a superfície do ágar.
2. Vire as placas de ensaio NGM de cabeça para baixo e rotule a parte inferior com um identificador para as cepas C. elegans a serem analisadas, 2 placas por cepa (Figura 1A).
3. Faça um pequeno ponto com o marcador no centro da placa de cabeça para baixo (Figura 1A).
4. Ao trabalhar com um microscópio de dissecação, transfira 15-20 vermes combinados em estágios para o centro da placa de ensaio diretamente sobre o ponto central (visível através do NGM) usando uma picareta de fio de platina (Figura 1B).
   NOTA: Tente transferir todos os worms ao mesmo tempo ou o mais rápido possível.
   1. Defina um cronômetro para 30 minutos depois que os vermes forem colocados no centro da placa. Coloque a tampa de volta no prato e reserve-a (Figura 1C).
5. Continue transferindo vermes até que todas as cepas estejam nas placas de ensaio designadas, anotando aproximadamente quanto tempo leva para transferir entre as placas (aponte para ~ 1 min entre as placas). Mantenha todas as placas na mesma ordem em que foram montadas.
6. Após 30 min, comece a marcar o primeiro prato.
   1. Remova a tampa e coloque a placa voltada para baixo sob o microscópio de dissecação, de modo que a parte de trás da placa rotulada fique voltada para cima e o ágar NGM fique entre a linha de visão e os vermes. A placa ficará de cabeça para baixo devido ao uso normal.
   2. Ajuste o foco do microscópio até que os vermes sejam visíveis através do ágar.
   3. Usando uma caneta hidrográfica de cor diferente do ponto central, coloque um pequeno ponto no local de cada verme - siga os rastros do verme pelo gramado bacteriano para encontrar os animais mais distais.
   4. Verifique a borda da placa, pois alguns vermes podem acabar lá. Além disso, conte e registre o número de vermes no ponto central (Figura 1D).
7. Continue marcando todas as placas de ensaio em ordem, de modo que todas as placas tenham 30 minutos de tempo de atividade, tomando cuidado para levar em conta o tempo necessário para configurar a placa. Em seguida, execute medições manuais ou digitais conforme descrito nas etapas 1.8 ou 1.9.
8. Realize medições manuais usando uma régua.
   1. Use uma régua para medir em mm, a distância do ponto central até as marcações de localização final para cada verme e registre a distância. Para ajudar a acompanhar o progresso durante a pontuação, rotule o primeiro ponto marcado com uma pequena linha de marcação.
   2. Registre os dados de comprimento de cada ponto consecutivamente girando a placa no sentido horário (Figura 1E).
9. Realize a medição digital usando um scanner e ImageJ.
   1. Usando um scanner de mesa, escaneie a parte de trás da(s) placa(s) de ensaio ao lado de uma régua (números voltados para a superfície de digitalização) (Figura 2A).
   2. Abra a imagem da chapa digitalizada no ImageJ ou em um programa semelhante.
      NOTA: ImageJ é um software gratuito de processamento de imagens baseado em Java hospedado pelo NIH.
   3. Clique na ferramenta Ferramenta de linha reta e, em seguida, desenhe uma linha conectando os pontos de 1 cm e 2 cm na imagem digitalizada da régua (Figura 2B).
      NOTA: Segurar a tecla Shift do computador forçará a linha para o ângulo de 45° mais próximo.
   4. Navegue até o menu Analisar e use-o para definir a escala (Analisar | Definir escala) (Figura 2C).
   5. Insira a Distância conhecida (10) e Unidades de comprimento (mm) nas caixas apropriadas, não ajuste a distância em número de pixels. Marque Global para aplicar a mesma escala a todas as imagens que estão sendo analisadas em cada sessão do ImageJ; caso contrário, defina a escala para cada imagem ao abrir (Figura 2D). Clique em Ok.
      NOTA: As etapas 1.9.2-1.9.5 são executadas para definir a escala de medição. As medições para esta imagem agora relacionarão automaticamente o comprimento das linhas com a relação pixel: comprimento definida. As imagens digitalizadas a 300 dpi terão uma relação aproximada de 11,8 pixels por mm.
   6. Use a Ferramenta Pincel para marcar logo acima do primeiro ponto a ser pontuado.
      NOTA: Este é um indicador visual para o primeiro worm marcado.
   7. Use a Ferramenta de linha reta para desenhar uma linha do ponto central até o primeiro ponto de dados do worm.
   8. Clique na tecla M no teclado para medir a distância. Como alternativa, navegue até o menu Analisar e escolha Medir (Analisar | Medida). Em ambos os casos, a medição aparecerá em uma nova janela; Esta janela coletará todas as medições por imagem.
   9. Mantendo o ponto central constante, mova a extremidade da linha que toca o primeiro ponto do sem-fim para o próximo ponto do sem-fim, movendo-se no sentido horário, e clique na tecla M para medir.
   10. Continue medindo cada ponto no sentido horário até que todos os pontos sejam marcados.
   11. Copie e Cole os dados de medição de comprimento em uma planilha para salvá-los. Em seguida, repita o processo para cada imagem de chapa digitalizada.
       NOTA: As etapas 1.9.6 a 1.9.11 medem os valores de deslocamento do sem-fim (Figura 2E-F).
10. Realize análises estatísticas.
    1. Combine réplicas em um único experimento para que um número total pontuado esteja entre 30 e 40 vermes.
    2. Realize réplicas experimentais independentes em dias diferentes e com populações independentes de vermes para obter 3 réplicas experimentais independentes.
    3. Analise os dados usando análises estatísticas apropriadas, como teste t de Student para 2 cepas ou ANOVA de 1 via para três ou mais cepas.

Resultados

Figura 1: Fluxo de trabalho do ensaio de locomoção radial. Os painéis A-E mostram as etapas generalizadas do ensaio de locomoção radial. As etapas são as seguintes: (A) As placas NGM, com OP50 semeado nas bordas, são preparadas rotulando e marcando o ponto central, (B) os vermes são colocados no centro do ágar conforme marcado pelo ponto central, (<...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C. elegans	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)	-	Adquira suas cepas conforme desejado, N2 é uma cepa de controle útil
Pipetas de borossilicato descartáveis em vidro borossilicato	VWR	14673-010	Pipeta de vidro usada para criar picareta de minhoca - segure a pipeta de vidro em uma mão e ~ 1 "de fio de platina (preso por um alicate) na outra sobre uma chama para unir.
Placas de Petri descartáveis, 35x10mm	VWR	10799-192	Placas de ensaio para o sistema de imagem WormLab
Placas de Petri descartáveis, 60x15mm	VWR	25384-090	Placas de estoque para minhocas
Placas de Petri descartáveis, 100x15mm	VWR	25384-302	Placa de ensaio de locomoção radial padrão
Placas de Petri descartáveis, 150x15mm	VWR	25384-326	Placa de ensaio de locomoção radial de período de tempo mais longo
Microscópio de dissecação	Leica	M80	Escopo para manutenção de vermes e configuração de ensaios de locomoção radial
Marcadores de ponta fina	VWR	52877-810	Precisa de pelo menos 2 cores para ensaios de locomoção radial. Pontas finas necessárias para precisão.
Scanner de mesa	Amazon	Epson Perfection V850	Opcional para ensaio de locomoção radial. O protocolo assume uma resolução de 300dpi, a maioria dos scanners funcionaria bem
NGM (Meio de Crescimento de Nematóides)	VWR	76347-412	Meio usado para cultivar C. elegans. Pode ser feito do zero, veja WormBook: Manutenção de C. elegans
Bactérias OP50	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)	OP50	Fonte primária de alimento para C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, usado em ensaios de natação
p1000 dicas	VWR	83007-384	Pontas para pipetador, usado em ensaios de natação
Fio de platina, 0,2032 mm de diâmetro	VWR	BT136585-5M	Fio de platina de calibre fino usado para criar picareta de minhoca - segure a pipeta de vidro em uma mão e ~ 1 "de fio de platina (preso por um alicate) na outra sobre uma chama para unir.
Régua	VWR	56510-001	Necessidade de pontuar ensaios de locomoção radial
ImagemJ	NIH	-	Software livre opcional fornecido por o NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
Sistema de imagem WormLab	MBF Biociência	WormLab	O sistema de imagem inclui Hardware WormLab (campo claro palco, câmera e caixa) e software WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- sistema