Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação
- Preparação e seccionamento de tecidos
- Classifique os ratos aleatoriamente em três grupos: fresco / salino (SAL; 0,9% NaCl), prefixado / SAL e prefixado / 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; veja detalhes na tabela 1).
- Administrar três doses de 1 ml/kg de SAL e 10 mg/kg de MDMA por via intraperitoneal, respetivamente, aos grupos SAL e MDMA com um intervalo de 2 horas. Permita que os animais sobrevivam ao tratamento por 6 dias.
- No dia 7, administre 100 mg / kg de cetamina em combinação de 5 mg / kg de xilazina por via intraperitoneal aos ratos para uma anestesia profunda (ou seja, perda dos reflexos de piscar da córnea e pinçamento da cauda).
- Para o grupo fresco / SAL, decapite rapidamente os ratos e remova o cérebro para o teste do cérebro fresco.
- Para os grupos prefixado/SAL e prefixado/MDMA, faça um corte ao longo do esterno cerca de 10 a 12 cm e, em seguida, exponha a extremidade do esterno.
- Segure a extremidade do esterno com um hemostático e corte o diafragma lateralmente em ambos os lados com uma tesoura afiada e, em seguida, corte para cima nas costelas e paralelamente aos pulmões.
- Com uma mão, segure a ponta ventral do coração com uma pequena pinça. Com a outra mão, perfure o ventrículo esquerdo com uma agulha de seringa de 18 G (observe que o lado adaptador da agulha está conectado com uma mangueira de silicone em forma de Y a recipientes gelados de SAL e paraformaldeído e bombas peristálticas).
- Ligue a bomba SAL no nível médio da vazão (~5 ml/min) e perfure o átrio direito com a pinça para permitir a saída da circulação de retorno. Mantenha a perfusão de SAL por 30 min.
- Ligue a bomba de paraformaldeído no nível médio e deixe o paraformaldeído a 4% gelado perfundir o animal por 30 min.
- Remova o instrumento de perfusão e decapite o animal. Faça um corte posteroanterior na linha média do crânio e, em seguida, bata o crânio para expor a cavidade craniana.
- Remova o cérebro com uma espátula da cavidade craniana e coloque o cérebro em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de paraformaldeído a 4%. Mantenha o cérebro dentro do tubo contendo paraformaldeído a 4 ºC na geladeira por 24 horas.
- Mova o cérebro para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de solução de sacarose a 30% a 4 ºC por 3 dias. Finalmente, armazene o cérebro em sacos plásticos a -80 °C até o uso.
- Monte o cérebro em um mandril com meio de incorporação e congele o meio de incorporação contendo o cérebro em um criostato à temperatura de -26 ºC. Corte o cérebro fresco congelado em seções de 20 μm e o cérebro com prefixo de paraformaldeído em seções de 10 μm. Transfira a seção para uma lâmina de microscópio em temperatura ambiente (RT) tocando a lâmina na seção.
- Seque ao ar em RT por 4 horas. Armazene as lâminas de corte em um saco hermético fechado a -80 ° C até o uso.
- desidratação
- Retirar as lâminas do congelador a -80 °C e atribuir secções a um de três ensaios: gene do recetor de serotonina 5-HT2A (ht2a), ppiB (gene da peptidilprolil isomerase B, controlo positivo) ou dapB (gene da di-hidrodipicolinato redutase bacteriana, controlo negativo); marcar e rotular secções com uma caneta esferográfica (não utilizar lápis). Mergulhe as lâminas em álcool 100% em RT por 5 min. Secar as lâminas durante 5 minutos numa hotte.
- Pré-tratamento
- Pipetar 20 μl do reagente de pré-tratamento-1 (inactivação da fosfatase alcalina) para as secções das lâminas. Coloque as lâminas em um trilho de rack em uma bandeja de umidade (observe que a bandeja é coberta com uma tampa para manter uma alta umidade para evitar a evaporação da solução de reação).
- Agitar suavemente o tabuleiro de humidade num agitador horizontal a uma velocidade baixa durante 10 min. Lavar as lâminas duas vezes com água bidestilada (ddH2O) durante 2 min. Mergulhar a lâmina num copo de 200 ml contendo 150 ml do reagente de pré-tratamento-2 (ruptura das ligações cruzadas induzida pela fixação do paraformaldeído). Ferva as lâminas por um total de 5 min a 100 ºC (restauração induzida pelo calor da estrutura do RNA).
- Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min. Colocar as lâminas em álcool 100% durante 5 min. Secar as lâminas durante 5 min na hotte. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da área selecionada na seção de tecido (por exemplo, estruturas não corticais, incluindo tálamo e hipotálamo, conforme descrito na Figura 1).
- Pipete 10 μl do reagente de pré-tratamento-3 (aumenta a penetração da sonda) para cada área selecionada e cubra a bandeja de umidade com a tampa. Coloque o tabuleiro no forno de hibridização equipado com o agitador horizontal e regule a temperatura do forno para 40 ºC; Agite suavemente a bandeja por 30 min. Lave as lâminas duas vezes com ddH2O por 2 min.
2. Hibridização e amplificação
- Pipetar 10 μl de reagentes de sonda htr2a, ppiB e dapB, respectivamente, nas áreas selecionadas. Cubra a bandeja de umidade com a tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite suavemente o agitador horizontal ajustado em velocidade baixa. Incubar as lâminas a 40 ºC na estufa durante 2 horas.
- Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por 2 min. Pipete 10 μl do reagente Amplification-1 em cada área selecionada, agite e incube as lâminas a 40 ºC por 30 min.
- Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por 2 min. Pipete 10 μl do reagente Amplification-2 em cada área selecionada, agite e incube as lâminas a 40 ºC por 15 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 μl do reagente Amplification-3 em cada área seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ºC durante 30 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 μl do reagente Amplification-4 em cada área seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ºC durante 15 min.
- Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por 2 min. Pipete 10 μl do reagente Amplification-5 em cada área selecionada, agite e incube as lâminas em RT por 30 min.
- Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por 2 min. Pipete 10 μl do reagente Amplification-6 em cada área selecionada, agite e incube as lâminas em RT por 15 min. Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por 2 min.
3. Detecção de sinal
- Pipete 10 μl do reagente vermelho para cada área selecionada (observe que o reagente é uma mistura de Red-B e Red-A na proporção de 1:60 e deve ser usado imediatamente). Coloque a corrediça na bandeja de umidade no agitador horizontal em RT e agite suavemente em velocidade baixa por 10 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com (ddH2O) durante 10 min. Secar as lâminas a 60 ºC na estufa durante 15 min. Colocar as lâminas em xileno sob a hotte durante 5 min. Pipetar 20 μl de suportes de montagem à base de xileno em cada área seleccionada e cobrir com uma lamínula.