Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Fatiamento do cérebro
- Oriente a amostra de modo que o lado dorsal do cerebelo fique na parte frontal. Despeje ACSF (líquido cefalorraquidiano artificial) de corte gelado, contendo 1 μM de TTX (Tetrodotoxina), suficiente para imergir completamente o cerebelo. Coloque um tubo de gás no ACSF e comece a borbulhar com a mistura de gás O2/CO2.
- Remova a aracnóide usando uma pinça fina sob binóculos. Corte o pedúnculo cerebelar com uma lâmina e remova o tronco encefálico e o bloco de ágar. Gire a bandeja 180°, de modo que a superfície dorsal do cerebelo fique voltada para uma lâmina de barbear.
- Ajuste a lâmina e ajuste o primeiro local de corte. Defina os parâmetros de fatiamento do vibratome para o seguinte: amplitude para 5.5, frequência para 85 Hz, velocidade para 3–4 e espessura da fatia para 300 μm.
- Transfira a fatia cerebelar em uma rede de náilon para uma incubadora de acrílico e mergulhe a fatia completamente no ACSF oxigenado. A incubadora deve ser colocada em banho-maria que mantenha uma temperatura de 26 °C.
- Armazene as fatias por pelo menos 1 h para permitir a recuperação dos danos durante o corte.
2. Gravação de patch-clamp de célula inteira
NOTA: Uma gravação de patch-clamp requer o seguinte equipamento: um microscópio vertical com óptica de contraste de interferência diferencial infravermelha (IR-DIC), um amplificador de patch-clamp, digitalizador de dados, estimulador digital, isolador, computador, software para aquisição e análise de dados, manipulador motorizado, plataforma de microscópio, mesa de isolamento de vibração, gaiola de Faraday, sistema de aquecimento de solução, bombas peristálticas e extrator de eletrodo.
- Adicione picrotoxina (0,1 mM) ao ACSF e resolva-a usando ultra-sonicação por 3 min.
- Perfundir uma câmara de registo com ACSF saturado de O2-CO2 contendo picrotoxinas a uma taxa de 2 ml/min. Manter a temperatura da câmara de registo a cerca de 30 °C.
- Faça um eletrodo de registro puxando um capilar de vidro borossilicato com filamento (diâmetro externo = 1,5 mm) usando um extrator com 4 etapas. O diâmetro da ponta deve ser de cerca de 1 μm.
- Faça um eletrodo estimulante puxando o mesmo capilar usando o extrator com 2 etapas e, em seguida, quebre para produzir uma ponta fina batendo a ponta contra um bloco de ferro sob um microscópio binocular. O diâmetro final deve ser de 3 a 5 μm.
- Transfira a fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe-a com um peso Pt com fios de nylon. Encha um eletrodo estimulante com ACSF.
- Para a estimulação dos PFs, coloque o eletrodo de estimulação na superfície da camada molecular, a cerca de 50 μm de distância da camada de células de Purkinje.
- Para estimulação da FC, coloque o eletrodo de estimulação na parte inferior da camada de células de Purkinje (etapas 3.3, 3.4).
- Filtre a solução interna à base de K+ ou Cs+ com um filtro de 0,45 μm. Use um micro-carregador para encher um eletrodo de registro com 8 μL de solução interna.
- Aplique uma pressão positiva fraca no eletrodo de registro antes de mergulhá-lo no ACSF. Sua resistência deve ser de 2 a 4 MΩ e o potencial juncional líquido deve ser corrigido.
- Aproxime-se do corpo celular saudável e brilhante do PC com o eletrodo de gravação. Empurre ligeiramente a superfície da célula de Purkinje, pare de aplicar pressão positiva, em seguida, aplique pressão negativa até formar uma vedação de giga-ohm. Em seguida, estabeleça a configuração de toda a célula usando pressão negativa.
- Mantenha o potencial de membrana em -70 mV e aplique pulso de -2 mV (duração, 100 ms) a 0,1 Hz para monitorar a resistência de entrada, resistência em série e capacitância de entrada, continuamente. Não use a compensação de resistência em série. Descarte os dados quando a resistência da série variar em mais de 15%.
3. Indução de LTD (depressão de longo prazo)
- Estimule a camada molecular com um pulso (duração, 0,1 ms). Identifique as correntes pós-sinápticas excitatórias PF (fibras paralelas) (EPSC) aplicando um estímulo de pulso duplo (intervalo interspike (ISI) de 50 ms). O PF-EPSC deve mostrar facilitação de pulso emparelhado e aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade da estimulação.
- Registre a resposta do teste do PF-EPSC aplicando um único pulso a 0,1 Hz. Ajuste a intensidade do estímulo para que a amplitude do EPSC evocado seja de cerca de 200 pA. Evite a contaminação da corrente através do canal iônico dependente da tensão.
- Estimule a FC na parte inferior da camada de células de Purkinje e identifique o EPSC provocado pela ativação da FC (aplicando um estímulo de pulso duplo). O CF-EPSC deve mostrar depressão de pulso pareada e uma maneira de tudo ou nada de acordo com o aumento da intensidade da estimulação. Para indução de LTD, um único estímulo deve ser usado.
- Protocolo de indução LTD 1
- Usando um eletrodo contendo solução interna à base de K + em condições de pinça de corrente, aplique um único estímulo PF e um único estímulo CF simultaneamente a 1 Hz por 5 min (300 pulsos) (Figura 1A).
- Protocolo de indução LTD 2
- Usando uma solução interna à base de K+ contendo eletrodo em condições de pinça de corrente, aplique estímulos PF duplos (ISI de 50 ms) e estímulo CF único, pois o segundo estímulo PF coincide com estímulos CF a 1 Hz por 5 min (Figura 1B).
- Protocolo de indução LTD 3
- Usando um eletrodo contendo solução interna à base de Cs + sob condições de grampo de tensão, aplique um estímulo PF duplo (ISI de 50 ms) e um único passo de tensão despolarizante (-70 a 0 mV, 50 ms) ao soma a 1 Hz por 3 min, de modo que o segundo estímulo PF seja equivalente ao início do passo de tensão despolarizante ( Figura 1C ).
- Protocolo de indução de LTD-4
- Usando um eletrodo contendo solução interna à base de Cs + sob condições de grampo de tensão, aplique os estímulos PF (5x a 100 Hz) e um único passo de tensão despolarizante (-70 a 0 mV, 50 ms) ao soma a 0,5 Hz por 3 min, simultaneamente (Figura 1D).
