Um modelo in vitro para estudar o cruzamento de patógenos da barreira hematoencefálica e a infecção de células cerebrais

Resumo

Fonte: da Costa, A., et al. Um modelo de interface sangue-cérebro humano para estudar cruzamentos de barreiras por patógenos ou medicamentos e suas interações com o cérebro. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um modelo in vitro para estudar patógenos que atravessam a barreira hematoencefálica (BBB). As células endoteliais microvasculares, que expressam junções apertadas, formam uma camada endotelial na câmara superior, enquanto neurônios, astrócitos e micróglia representam o parênquima cerebral na câmara inferior, separados por uma membrana porosa. A infecção por vírus no modelo BBB imita o patógeno que passa do sangue para o cérebro. Ao introduzir um vírus neurotrópico, ele atravessa a BHE via transcitose, infecta células neurais, replica e libera progênie viral, demonstrando neuroinvasão bem-sucedida.

Protocolo

1. Construção e controle de qualidade do BBB-Minibrain (Barreira hematoencefálica - Minibrain) (Figura 1)

1. Configurando um dispositivo de inserção de cultura de membrana de poliéster BBB-Minibrain (Figura 1B)
   1. Cultive a linha de células endoteliais do cérebro humano (células hCMEC / D3) em filtros de inserção de cultura de membrana de poliéster de 12 poços por 6 dias em meio de células endoteliais antes de usá-los para o experimento.
   2. Cubra uma placa de 12 poços com poli-D-lisina (1 mL / poço, 10 μg / mL, 4 h em RT) e, em seguida, laminina (1 mL / poço, 1 μg / mL, durante a noite em RT).
   3. Remova a laminina e adicione 1 mL de meio de células endoteliais suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) (5% de meio de células endoteliais).
   4. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de humidade.
   5. Tripsinize suavemente os neurônios humanos pós-mitóticos (hNeurons) e astrócitos humanos (hAstrócitos) (NT2-N/A) e a linha celular microglial humana (CHME/Cl5) e dissocie os pellets celulares com meio celular endotelial completo.
   6. Conte as células, misture 3,6 x 10 ⁵ NT2-N / A e 0,4 x 10 ⁵ células CHME / Cl5 / poço e semeie a placa de 12 poços.
   7. Em T=24 h (24 h após a semeadura): troque o meio usado por meio de células endoteliais completas frescas (células Minibrain e células endoteliais) e transfira o filtro de inserção de cultura de membrana de poliéster hCMEC/D3 na parte superior das células Minibrain. Incubar o BBB-Minibrain a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade.
      NOTA: O BBB-Minibrain consistirá então em uma camada de células endoteliais humanas hCMEC / D3 no filtro isolando o compartimento luminal (ou compartimento "sangue") e de uma cultura mista de células humanas hNT2-N / A e hCHME / Cl5 (Minibrain) na parte inferior do poço definindo o compartimento abluminal (ou compartimento "cérebro") (Figura 1B ).
2. Validação da permeabilidade endotelial do BBB-Minibrain (Controle de Qualidade) (Figura 1C)
   1. Prepare o tampão de transporte (TB), que é o tampão HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) com Ca²⁺ e Mg²⁺ suplementado com 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e 1 mM de piruvato de sódio.
   2. Prepare placas de 12 poços com 1,5 mL de tampão de transporte por poço.
   3. Em T = 0, faça um novo tampão de transporte suplementado com 50 μM de amarelo de lúcifer (LY-TB).
   4. Inverta cada filtro de cabeça para baixo para remover cuidadosamente o meio sem afetar a barreira celular endotelial.
   5. Coloque o filtro na placa cheia de 12 poços e adicione 0,5 mL de LY-TB.
   6. Incubar as placas em uma incubadora a 37°C, 5% de CO₂ e 95% de umidade.
   7. Em T = 10 min, transfira os filtros em novas placas de 12 poços cheias de TB e mantenha o compartimento abluminal da primeira placa para leitura de OD.
   8. Em T= 25 min, repita o passo 1.2.7.
   9. Em T= 45 min, pare o transporte removendo os filtros das placas. Manter compartimentos abluminais e luminais para medidas de DO.
   10. Transfira em placas escuras de 96 poços as amostras: 10 μL com 190 μL TB para o LY-TB e os compartimentos luminais, 200 μL de amostra para os compartimentos abluminais.
   11. Medir a fluorescência do LY-TB presente nas diferentes amostras a λ428 nm, λ535 nm (ondas de excitação e comprimento de emissão, respectivamente).
   12. Calcule a permeabilidade endotelial (Pe) em direção à TB-LI (Pe_LY) usando a fórmula:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) e Pe_LY= PSe/S.
       NOTA: PSf é a permeabilidade do filtro sem células, PSt é a permeabilidade do filtro com células, PSe é a permeabilidade da monocamada endotelial cronometrada a superfície da monocamada, S é a superfície da monocamada (para um filtro de 12 poços = 1,12 cm ² ), Pe_LY é expresso em cm/min. Para hCMEC/D3 o Pe_LY deve estar entre 0,7 e 1,2 x 10^-3 cm/min dependendo principalmente do FBS usado nos experimentos. Importante: um Pe_LY maior que 1,2 significa que o BBB não está apertado o suficiente e algum vazamento pode ser observado. Descarte essas barreiras.

2. Uso do BBB-Minibrain para destacar a presença de partículas virais neuro-invasivas em uma amostra de vacina contra o vírus da febre amarela, o vírus neurotrópico francês, YFV-FNV 34 (Figura 2)

1. Cruzamento e multiplicação de vírus da febre amarela no Minibrain
   1. Utilizar o BBB-Minibrain preparado conforme descrito no passo 1.1.7 24 h antes da adição do vírus; substitua o meio por 2% de meio de células endoteliais FBS.
      NOTA: É extremamente importante evitar alterar o meio antes de adicionar o vírus. A mudança do meio pode ativar as células endoteliais humanas e abrir transitoriamente a barreira que permitirá a passagem do vírus. Aqui o meio é trocado 24 horas antes de iniciar o experimento.
   2. Em T = 0, adicione 3500 Unidades Formadoras de Placas (PFU) de YFV-FNV diluídas em 50 μL de meio de células endoteliais FBS a 2% com muito cuidado na parte superior do compartimento luminal. O controle BBB-Minibrain é inoculado com 50 μL de meio de células endoteliais FBS a 2% sem vírus. Determine Pe_LY no poço complementar.
   3. Incubar o BBB-Minibrain em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade.
   4. Após 24 h, remover o dispositivo filtrante das inserções de cultura da membrana de poliéster e determinar Pe_LY, recolher 1 ml do compartimento abluminal e titular o vírus. Substitua o meio por meio de células endoteliais FBS fresco a 2%.
   5. Incubar o BBB-Minibrain a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade.
   6. Após 72 h, amostrar o meio do compartimento abluminal e titular o vírus e/ou extrair o RNA das células Minibrain para análise da expressão gênica.

Resultados

Figura 1: o modelo BBB-Minibrain. A. Cronograma das culturas hCMEC/D3 e fotografia do dispositivo BBB-Minibrain: um filtro de inserções de cultura de membrana de poliéster com barreira endotelial hCMEC/D3 é segurado com uma pinça antes de ser inserido em um poço de uma placa de cultura de células de 12 poços. B. Desenho animado descrevendo o dispositivo com o compartimento luminal (s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 12 poços	Corning	3336
Placa de Petri de 85 mm	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	A pedido do Dr. Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Placas escuras de 96 poços	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Etanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	meio de células endoteliais
HBSS com Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedrolane	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Scientific	15630-070
Laminina	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamina	Thermofisher Scientific	25030-024
Amarelo Lúcifer	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	15714
PBS sem Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
Caneta/Strep	Eurobio	CXXPES00-07
Poli-d-lisina	Merck-Sigma Aldrich	Pág. 1149
Prolongar Ouro	Thermofisher Scientific	Pág. 36930
Kit de purificação de RNA	QIAGEN	74104
Bicarbonato de sódio 5,6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Piruvato de sódio	Thermofisher Scientific	11360
Célula T75+ Frasco	Sarstedt	83-1813-302	Balão de poliestireno para cultura de tecidos com tratamento de superfície específico (Cell+) para células aderentes sensíveis
Transwell	Corning	3460	inserções de cultura de membrana porosa de poliéster
Tripsina-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Água Ultra Pura	Thermofisher Scientific	10977-035
Verso	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Frasco para injetáveis de vacina