1. Preparando moscas para experimentos MultiColor FlpOut (MCFO)
NOTA: A técnica MCFO refere-se a uma versão modificada da chamada excisão de cassete de parada mediada por Flp (FlpOut). As moscas MCFO transgênicas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-Flp recombinase e diferentes repórteres sob controle de sequência de ativação a montante (UAS). Cada repórter consiste em uma espinha dorsal comum de uma proteína fluorescente verde de superpasta miristoilada (myr) (sfGFP), na qual 10 cópias de uma tag de epítopo (por exemplo, HA, FLAG ou V5) foram inseridas. As proteínas não fluorescentes resultantes são chamadas de "GFPs de monstro espaguete" (smGFPs) e podem ser detectadas usando anticorpos específicos contra as diferentes tags de epítopos.
- Voos cruzados com o cassete MCFO e o hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) para as linhas de driver glial GAL4 apropriadas (consulte a Tabela de Materiais).
- Como o hsp já está ativo a 25 °C e poucas células podem sofrer recombinação levando a uma marcação inespecífica, configure cruzamentos a 18 °C para evitar vazamentos do sistema. Aguarde cerca de 20 dias a 18 °C para obter a geração F1. Após o choque térmico (ver passo 2), manter as moscas a 25 °C (figura 1).
2. Choque térmico
NOTA: Dependendo do local de inserção, a eficiência do hsp-Flp pode ser diferente; portanto, o tempo ideal de choque térmico deve ser otimizado. Para este protocolo, foi utilizado um porta-moscas MCFO no qual o hsp-Flp foi inserido no cromossomo X (ver Tabela de Materiais).
- Transfira a progênie do cruzamento na etapa 1.1 (moscas da geração F1, 3-4 dias de idade) para novos frascos contendo alimentos e choque térmico a 37 °C em banho-maria.
nota: As moscas jovens (1-2 dias de idade) são muito sensíveis ao choque térmico. Aguarde mais 1 ou 2 dias antes de realizar o choque térmico para reduzir a taxa de mortalidade causada pelo tratamento. Use algumas das moscas da geração F1 como controle, sem choque térmico.
- Durante o choque térmico, mantenha as moscas em frascos normais com alimentos para diminuir a taxa de mortalidade induzida pelo estresse. Coloque fêmeas e machos em frascos separados.
- Certifique-se de mergulhar todo o frasco na água para garantir um choque térmico homogêneo. Use um choque de 5-8 minutos como um ponto de partida adequado para a rotulagem esparsa de células da glia com muitas linhas de driver GAL4; A duração do choque deve ser otimizada para cada driver e experimento (tempos de choque térmico mais curtos ou mais longos podem ser necessários).
- Após o choque térmico, coloque os frascos horizontalmente na bancada por alguns minutos para permitir que as moscas se recuperem do choque térmico.
nota: Não é necessário trocar os frascos para injetáveis.
- Mantenha as moscas a 25 °C e disseque-as (consulte as etapas 3 e 4) 2 ou mais dias após o choque térmico para uma expressão ideal do repórter.
3. Preparação e soluções de dissecação
- No dia da dissecção, prepare uma solução fixadora fresca em tubos de PCR de 200 μL, misturando 180 μL de meio de cultura de células S2 com 20 μL de paraformaldeído (PFA) a 20% para obter uma solução de PFA a 2%. Manter a solução fixadora em gelo antes e durante a dissecção.
cuidado: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
nota: Misture 160 μL de meio de cultura de células S2 com 40 μL de paraformaldeído (PFA) a 20% em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 200 μL para preparar uma solução de PFA a 4% em vez de uma solução a 2%.
- Use um tubo de PCR por genótipo com um máximo de 8 a 10 cérebros por tubo para obter os melhores resultados de coloração.
- Prepare a solução de lavagem cerebral para adultos: 0,5% de albumina de soro bovino, 0,5% de Triton X-100 em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Dependendo da coloração, pode ser necessária uma solução contendo 1% de Triton X-100. Uma concentração mais alta de Triton X-100 aumenta a penetração do anticorpo no tecido e é necessário corar regiões que se encontram profundamente dentro do tecido (por exemplo, regiões sinápticas no cérebro adulto de Drosophila).
- Prepare a solução de bloqueio: 3% de soro normal de cabra, 3% de soro normal de burro e 0,5% de Triton X-100 em PBS.
- A solução de lavagem cerebral adulta e a solução de bloqueio podem ser armazenadas a 4 °C por algumas semanas.
- Coloque a placa de vidro dos poços de depressão profunda no gelo e encha cada poço com as seguintes soluções: uma com etanol a 70%, uma com PBS e outra com meio de cultura de células S2.
4. Dissecção do cérebro adulto
- Posicionar uma cápsula de dissecação de 3 cm na fase de um estereomicroscópio e enchê-la com meio de cultura de células S2 frio. Realize todas as dissecções neste meio para garantir que o tecido permaneça saudável durante o procedimento de dissecção.
nota: Use uma placa de dissecação forrada com vários milímetros de silicone preto que fornece um bom contraste de fundo (nas imagens) e preserve a pinça durante a dissecção.
- Anestesiar as moscas do genótipo desejado com CO2.
- Com uma pinça, agarre a mosca pelas asas e lave-a em etanol frio a 70% por 30 s, depois com PBS frio por mais 30 s.
- Transfira a mosca para o poço de depressão profunda que é preenchido com meio de cultura de células S2.
- Repita o mesmo procedimento para todas as moscas do mesmo genótipo e mantenha-as em meio de cultura de células S2 frio até a dissecação, o que preservará o tecido.
nota: Anestesiar apenas o número de moscas que podem ser dissecadas em um período de tempo de cerca de 30 min. Longos tempos de incubação em meio de cultura de células S2 podem danificar o tecido.
- Pegue a mosca com uma pinça e, sob um estereomicroscópio, mergulhe a mosca em meio de cultura de células S2.
- Separe a cabeça do resto do corpo. Descarte o corpo e mantenha a cabeça submersa em meio de cultura de células S2. É extremamente importante segurar a cabeça com uma pinça durante toda a duração da dissecção. Se a cabeça começar a flutuar, será difícil recuperá-la sem danificar o tecido.
- Comece a dissecção puxando um olho, enquanto segura a cabeça com pelo menos uma pinça o tempo todo. Certifique-se de que a ponta da pinça esteja logo abaixo da retina para evitar danificar o tecido por baixo. Puxe o outro olho e comece a remover a cutícula até que o cérebro apareça.
- Remova todo o tecido traqueal e cutícula ao redor do cérebro até que o tecido pareça limpo. Certifique-se de remover todo o tecido traqueal ao redor do cérebro para obter os melhores resultados de coloração; Os tecidos agora estão prontos para serem fixados e corados.
- Manter todos os cérebros dissecados em meio de cultura de células S2 frio antes de os transferir para a solução de PFA, a fim de cronometrar a etapa de fixação.
5. Coloração do cérebro adulto
- Transfira o cérebro isolado com uma pipeta P10 para a solução de PFA à temperatura ambiente (RT). Para evitar danos aos tecidos, nunca use fórceps para transferir os cérebros após a dissecção. Execute todas as etapas em tubos de PCR de 200 μL em um nutador.
- Para todas as etapas, antes de descartar a solução antiga com uma pipeta P200, deixe o cérebro se acomodar no fundo do tubo. Tente remover o sobrenadante sem aspirar o tecido. Proteja o tecido da exposição à luz.
- Fixe os cérebros em 200 μL de PFA a 2% em meio de cultura de células S2 por 1 h ou em PFA a 4% por 30 minutos. Manter os tempos de fixação idênticos entre as amostras, a fim de aumentar a reprodutibilidade.
- Após 3 (ou mais) lavagens de 15 minutos cada em 200 μL de solução de lavagem cerebral em adultos, bloqueie os tecidos com 200 μL de solução de bloqueio por 30 minutos. Tempos de incubação mais longos na solução de bloqueio são possíveis.
- Incubar os cérebros durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em solução de lavagem cerebral adulta num volume total de 200 μl.
nota: Os tempos de incubação podem variar dependendo do tipo de anticorpo usado. Incubações mais longas podem ser necessárias.
- Para a marcação dos três marcadores MCFO, incube os cérebros com anticorpos primários anti-HA (1:500), anti-FLAG (epítopo DYKDDDDK) (1:100) e anti-V5.
- Anticorpos primários diretamente conjugados podem ser usados em vez da combinação primária + secundária normal (por exemplo, anti-V5:DyLight 549 (1:200)). Nesse caso, trate os anticorpos diretamente conjugados como anticorpos secundários.
nota: Para cada genótipo, mantenha alguns cérebros como controles para verificar a especificidade da coloração. Pule a incubação primária de anticorpos e vá diretamente para a próxima etapa.
- Lavar os tecidos 3 vezes durante 1 h em 200 μL de solução de lavagem cerebral em adultos (passo 3.3) e incubá-los com conjugados de fluoróforos secundários/anticorpos primários diretamente conjugados diluídos em solução de lavagem cerebral em adultos durante a noite a 4 °C ou durante 4 h em RT, num volume total de 200 μL
nota: Exemplos de anticorpos apropriados: anticorpos conjugados com AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) e DyLight 647 (1:100).
- Lave os cérebros 3 vezes por 1 h em 200 μL de solução de lavagem cerebral para adultos, seguida de uma lavagem final em 200 μL de PBS durante a noite a 4 ° C ou por 1-2 h em RT; a etapa final de lavagem em PBS remove quaisquer vestígios de Triton X-100 e é necessária para obter os melhores resultados de coloração. Monte os cérebros em meio de montagem com um agente anti-desbotamento em lamínulas de vidro.
6. Montagem de cérebros para imagens
- Apare um espaçador de imagem no tamanho apropriado usando uma tesoura. Para microscopia de alta resolução, coloque a amostra e o espaçador de imagem entre duas lamínulas de vidro.
nota: Os espaçadores de imagem são espaçadores adesivos finos (0,12 mm de espessura) que descascam e colam em lamínulas de vidro ou lâminas de microscópio, permitindo a montagem de amostras sem compressão.
- Com uma pinça, remova o revestimento adesivo de uma superfície e aplique o espaçador, com o lado adesivo voltado para baixo, na superfície de uma lamínula de vidro (22 mm x 60 mm). Aplique 10 μL de meio de montagem em uma nova lamínula de vidro.
- Com uma pipeta P10, transferir os cérebros do tubo de 200 μL para a lamínula, junto à gota do meio de montagem. Juntamente com os tecidos, transfira um pouco de PBS para manter os cérebros em solução.
- Com uma pipeta P10, mova os cérebros do PBS para a gota do meio de montagem tentando limitar a quantidade de PBS. Transfira as amostras em meio de montagem na lamínula com o espaçador de imagem. Use mídia de montagem suficiente para cobrir a amostra.
- Remova o outro revestimento adesivo da parte superior do espaçador e adicione uma lamínula de vidro sobre as amostras. Com a ponta de uma pinça, aplique uma leve pressão sobre a área adesiva para selar. Fotografe os tecidos montados imediatamente ou armazene as lâminas a -20 °C para análise posterior.
