Uma técnica de ablação guiada estereotáticamente para remoção do córtex auditivo em ratos

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do Rato

NOTA: Realizamos os experimentos em ratos machos para evitar alterações hormonais.

1. Anestesiar o animal com uma mistura de cloridrato de cetamina (30 mg/kg) e cloridrato de xilazina (5 mg/kg) injetados por via intramuscular; com esta dose, o rato deve ser profundamente anestesiado por cerca de 1 h.
2. Aperte o dedo do pé do rato; a ausência de um reflexo de retirada indica que o animal está totalmente inconsciente. Se o rato responder ao beliscão, dê anestesia suplementar em um terço da dose inicial.
3. Raspe o couro cabeludo e desinfete a área cirúrgica com iodopovidona.
4. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para manter uma temperatura de 38 °C e estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica usando duas barras de ouvido e uma barra de mordida. Tenha cuidado para evitar perfurar a membrana timpânica com as barras auriculares.
5. Proteja os olhos aplicando uma gota de gel oftálmico ou soro fisiológico em cada olho.

2. Localização do AC no osso temporal do rato

1. Usando um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre a superfície do crânio.
2. Use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue que cubra a superfície do crânio para visualizar bregma, lambda e interaural 0 de acordo com o atlas de Paxinos e Watson do cérebro de rato.
3. Faça uma incisão no músculo temporal próximo à sua inserção dorsal no crânio com um bisturi. Puxe o músculo para fora usando uma agulha e material de sutura e fixe o material de sutura na estrutura estereotáxica; Isso irá expor o osso temporal. Se ocorrer sangramento, enxágue com solução salina estéril fria.
4. Coloque uma agulha reta estéril no micromanipulador estereotáxico, certificando-se de que esteja totalmente presa.
5. Abaixe lentamente a agulha até que esteja logo acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha fique na posição interaural 0. Defina este ponto como zero e determine as coordenadas a partir deste ponto.
6. Dependendo da área de interesse do cérebro, varie as coordenadas estereotáxicas. Determine essas coordenadas utilizando o atlas de Paxinos e Watson do cérebro do rato. Depois que as coordenadas forem determinadas, mova a agulha para corresponder a essas coordenadas.
7. Mire na CA usando as coordenadas dos quatro pontos a seguir: A: ântero-posterior (A/P) = -5,8 mm, mediolateral (M/L) = +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. Abaixe a agulha logo acima do osso temporal para visualizar cada um desses quatro pontos. Usando uma caneta marcadora, marque os pontos no osso temporal e conecte-os para desenhar um retângulo; o retângulo servirá como guia para abertura de uma janela no osso (Figura 1).

3. Exposição cirúrgica da CA

1. Abra a janela usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena (0,6 mm Ø). Perfure o perímetro do retângulo a 8.000 rpm até que o osso ceda. Resfrie a superfície de perfuração enxaguando com solução salina estéril fria para evitar danos às estruturas subcorticais. Quando o osso cede, uma queda na resistência pode ser detectada. Tenha cuidado para não perfurar o cérebro.
2. Quando as bordas estiverem soltas, puxe o osso de cobertura com uma pinça fina e guarde-o em solução salina estéril fria.

4. Ablação do AC

1. Usando um microscópio cirúrgico (10X), corte suavemente as meninges com uma faca microcirúrgica e remova-as usando duas pinças de ponta fina. Se ocorrer sangramento, enxágue com solução salina estéril fria.
2. Aspire suavemente o AC usando um dispositivo de sucção cirúrgica (pressão -0,24 bar) acoplado a uma agulha estéril de ponta romba de 20 G. Este ponto é crítico e precisa ser realizado com muito cuidado: aspire apenas as seis camadas corticais e não a substância branca subjacente.
3. Aspire até que as artérias perfurantes parem de sangrar.
4. Quando a aspiração estiver concluída, cubra a área lesionada com o osso extraído e aplique uma gaze hemostática absorvível.
5. Deixe o músculo temporal recuperar sua posição original e, em seguida, suture a pele usando clipes de ferida (9 mm). Aplique pomada antibiótica. Continue a aplicar pomada na ferida duas vezes ao dia por três dias.
   NOTA: Cada aplicação consiste em uma camada fina aplicada na ferida.
6. Injete buprenorfina por via subcutânea no dorso do rato (0,05 mg / kg) como analgésico 1 h após a cirurgia e, em seguida, a cada 8 h durante 72 h.
7. Mantenha o animal na almofada de aquecimento até que ele acorde e devolva-o à gaiola para se recuperar.

Figura 1: Imagens do osso temporal do rato em três diferentes etapas cirúrgicas. (A) Transferência das coordenadas estereotáxicas da CA para o osso temporal. As coordenadas dos quatro pontos são: A: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. (B) As coordenadas são usadas como referência para desenhar um retângulo na superfície do osso temporal que guiará a abertura de uma janela. (C) Mostra a janela aberta no osso após a perfuração. As meninges com vasos sanguíneos podem ser observadas na superfície do cérebro. R: rostral, D: dorsal.