Dia 1
1. Marcação das mitocôndrias de células-tronco mesenquimais (MSC)
- Dois dias antes da preparação das mitocôndrias, semear CTMs humanas em uma placa de 100 mm, em 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (Soro fetal bovino) 10%, de modo a ter 4 x 105 CTMs em cultura no Dia 1.
- Enxágue as MSCs com PBS (4 ml) e adicione 4 ml de αMEM/FBS 1% (pré-aquecido a 37 °C).
- Adicione a quantidade necessária de corante vital da mitocôndria e incube as células por 30 min na incubadora a 37 °C.
- Remover a solução de corante mitocondrial, enxaguar as células duas vezes com 4 ml de αMEM/FBS 1% pré-aquecido (37 °C) e adicionar novamente 4 ml de αMEM/FBS 10%. Incubar as células a 37 °C.
- Troque o meio de cultura (10 ml αMEM/FBS 10%) após 30 min e, outra vez, 2 horas depois.
Dia 1
2. Marcação das células-tronco de glioblastoma (GSC)
- Dissociar a linhagem celular Gb4 de GSCs (10 x 106 células) cultivadas como neuroesferas em frascos de cultura de células revestidos com poli-HEMA
- Semear GSCs em uma placa de 48 poços a 105 células/poço em meio de proliferação GSC (500 μl) (ver Tabela 1).
- Centrifugue a placa a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Adicione a quantidade necessária de corante vital celular e incube por 30 min a 37 °C.
- Adicionar 500 μl de meio basal GSC (Tabela 1) por alvéolo da placa de 48 poços.
- Centrifugar a placa a 270 x g a 20 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Repita as etapas 2.5 a 2.6.
- Adicionar 500 μl de GSC basal
- Centrifugar a placa a 270 x g a 20 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Adicione 500 μl de meio de proliferação de GSC por poço da placa de 48 poços e incube na incubadora de 37 °C.
nota: A quantidade de GSCs indicada (10 x 106 células) permite realizar os diferentes experimentos dose-resposta e controles FACS. Uma vez que as condições experimentais sejam definidas com mais precisão, essa quantidade pode ser reduzida.
3. Semeadura de células-tronco de glioblastoma
- Colete as neuroesferas GSC (células-tronco de glioblastoma) (10 x 106 células) por centrifugação a 270 x g por 5 min, a 20 ° C em um tubo de 50 ml.
- Lave as células com 5 ml de HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) e centrifugue a 270 x g por 5 min a 20 °C.
- Aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda suavemente o grânulo GSC em 100 μl de tripsina-EDTA (ácido etilenodiamina tetracético) (0,25%) (por 10 x 106 células)
- Incubar a 37 °C durante 3 min.
- Adicione 10 μl de CaCl2 (20 mM) e 2 μl de DNase I (10 mg/ml).
- Dissocie as neuroesferas pipetando suavemente para cima e para baixo (30-50x) com uma pipeta P200. Evite bolhas. Verificar ao microscópio se todos os GSC estão dissociados.
- Adicione 10 μl de inibidor de tripsina (5%) e 10 ml de HBSS.
- Centrifugue os GSCs a 270 x g por 7 min a 20 °C.
- Rejeitar o sobrenadante e adicionar 10 ml de meio basal GSC.
- Contar as GSC com uma câmara de contagem de Thoma e, em seguida, centrifugar as células a 270 x g durante 7 min a 20 °C.
- Adicionar o volume adequado de meio de proliferação de GSC para atingir a concentração celular de 106 GSC/ml.
- Semear 105 GSCs (100 μl da suspensão celular) por alvéolo de uma placa de 96 poços.
- Centrifugue as placas a 270 x g durante 7 min a 20 °C para obter GSCs no fundo dos poços.
- Incubar a placa de 96 poços a 37 °C.
Dia 2
4. Isolamento de mitocôndrias MSC (células-tronco mesenquimais)
- Ajuste a temperatura da centrífuga de microtubos para 4 °C.
- Preparar dois tubos de 1,5 ml "A" e "C" contendo os reagentes para a extracção das mitocôndrias (200 μl de reagente A e 400 μl de reagente C, ambos contendo os inibidores da protease sem EDTA). Prepare 2 outros tubos, rotulados como "MSC" e "Mito". Mantenha todos os tubos no gelo. Prepare também tubos para as diluições seriadas das mitocôndrias.
- Lave as MSCs com 10 ml de PBS pré-aquecido (37 ° C) (solução salina tamponada com fosfato).
- Lave as MSCs com 2 ml de tripsina (sem EDTA) por 10 segundos e adicione 1 ml de tripsina (sem EDTA). Incube as células por 5-10 min a 37 °C.
- Recupere as MSCs adicionando 10 ml αMEM / FBS 10%, transfira para um tubo de 50 ml.
- Centrifugar as células a 270 x g durante 5 min a 20 °C.
- Rejeitar o sobrenadante e adicionar 10 ml de αMEM/FBS 10% ao sedimento celular.
- Conte as MSCs com uma câmara de contagem de Malassez.
- Centrifugue MSCs (4-5 x 105) a 270 x g por 5 min a 20 °C.
- Descarte o sobrenadante, adicione 1 m de αMEM/FBS 10% gelado ao pellet celular e transfira as células para o tubo marcado com "MSC". Mantenha o tubo no gelo.
- Centrifugar o tubo que contém as MSC a 900 x g durante 5 min, a 4 °C.
- Remova todo o meio residual do tubo.
- Adicione 200 μl de Reagente de Isolamento de Mitocôndrias A (contendo os inibidores de protease livres de EDTA). Vortex em velocidade média por 5 segundos e deixe os tubos no gelo por exatamente 2 min.
- Adicione 2,5 μl de Reagente de Isolamento de Mitocôndrias B. Vórtice na velocidade máxima por 10 segundos e, em seguida, deixe os tubos no gelo. Repita a cada 30 segundos por 5 min.
- Adicionar 200 μl de Reagente de Isolamento de Mitocôndrias C (contendo os inibidores de protease isentos de EDTA). Misture inclinando o tubo (cerca de 30 vezes, não vórtice). Centrifugar o tubo a 700 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfira o sobrenadante (contendo as mitocôndrias MSC) para o tubo "Mito".
- Centrifugue a 3.000 x g, 15 min a 4 °C, para obter o pellet mitocondrial. Descarte o sobrenadante. O pellet contém as mitocôndrias isoladas.
- Enxágue o pellet mitocondrial com 200 μl do Reagente C. Em seguida, centrifugue a 12.000 x g, 5 min a 4 °C, para obter o pellet de mitocôndria.
5. Transferência de mitocôndrias isoladas de MSC para GSCs (MitoCeption)
- Adicionar 200 μl do meio de proliferação de GSC pré-arrefecido (0 °C) ao sedimento de mitocôndrias isolado de MSC (4 x 105).
- Diluir a preparação mitocondrial (em meio de proliferação de GSC) para adicionar consistentemente 20 μl de suspensão mitocondrial aos GSCs.
- Adicionar o volume das mitocôndrias isoladas aos alvéolos da placa de 96 poços que contém as GSC, à concentração desejada (0,1 a 10 μg). Adicione as mitocôndrias lentamente, perto do fundo do poço, cobrindo toda a superfície pelo menos uma vez.
- Centrifugue a placa de 96 poços contendo as GSCs receptoras das mitocôndrias com as mitocôndrias MSC e a placa de controle a 1.500 x g por 15 min a 4 ° C.
- Colocar as placas de cultura na incubadora de células a 37 °C imediatamente após a centrifugação.
nota: O protocolo de transferência de mitocôndrias baseia-se na centrifugação da suspensão mitocondrial nas células cultivadas com a força de centrifugação adequada, com um número de centrifugações que podem ser ajustadas dependendo do sistema de células doadoras/receptoras das mitocôndrias.
Tabela 1: Meios de cultura.
| Meio de cultura celular | composição |
| GSC meio basal | DMEM/F-12 suplementado com |
| Insulina 20 mg/ml |
| Suplemento N2 1x |
| Glicose 3 g/L |
| L-glutamina 2 mM |
| Meio de proliferação GSC | Adicione ao meio basal: |
| Suplemento B27 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Fungina 10 mg/ml |
| Fungizone 0,25 mg/ml |
| Heparina 2 mg/ml |
| Ciprofloxacina 2 μg / ml |
| Gentamicina 2 μg/ml |
| Meio de proliferação MSC | αMEM suplementado com |
| L-glutamina 2 mM |
| 10% FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
