Coloração de fluorescência de células da crista neural cultivadas em hidrogéis de rigidez variável

Resumo

Fonte: Le, T. P., et al., Um sistema otimizado de O9-1/hidrogel para estudar sinais mecânicos em células da crista neural. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para realizar a coloração de fluorescência usando microscopia de fluorescência para demonstrar a coloração com faloidina de células da crista neural cultivadas em hidrogéis de rigidez variável para visualizar e analisar a organização do citoesqueleto.

Protocolo

1. Análise molecular da rigidez por meio de coloração por imunofluorescência

1. Use uma pinça para transportar a lamínula para uma nova placa para minimizar os sinais falsos das células cultivadas diretamente na placa. Lave as células com 500 μL de PBS estéril três vezes para remover as células mortas e qualquer meio de cultura restante.
2. Fixe as células usando 500 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, relavar as células três vezes usando 500 μL de PBS/poço por 2 min cada.
   NOTA: Armazene a 4 °C para uma parada de procedimento.
3. Trate as células com 500 μL de Triton X-100 a 0,1% por 15 min em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com 500 μL de PBS/poço.
4. Bloqueie as células com 250 μL de soro de burro a 10% (diluído em PBS e 0,1% Tween 20) por poço por 30 min em temperatura ambiente.
5. Incube as células com faloidina usada para coloração de F-actina em uma diluição de 1:400 em 250 μL de soro de burro a 10% por 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células três vezes com PBS por 5 min cada.
   NOTA: A faloidina de 568 nm pode ser co-incubada com anticorpos secundários de 488 nm ou 647 nm ou sozinha.
6. Incubar as células com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, diluição 1:1000) em 250 μL de PBS por 10 min, seguido de uma última lavagem de PBS por 2 min.
7. Adicione 3-4 gotas de meio de montagem a cada poço. Armazene as amostras a 4 °C para endurecer por pelo menos 2 h antes da imagem para garantir que o meio de montagem foi ajustado corretamente.
8. Com um microscópio de fluorescência, capture imagens de pelo menos 3 quadros aleatórios por amostra de hidrogel, produzindo canais individuais e mesclados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2 mm #1 Corning 0211 lamínula de vidro	Ciências da Vida Chemglass	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Lamínula de Vidro	Ciências da Vida Chemglass	CLS-1763-025
Placa de cultura de células de 4 poços	Thermo Scientific	179830
4% Paraformaldeído	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% de acrilamida	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 Faloidina	Thermo Fisher	A12379
Colágeno tipo I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)	Thermo Fisher	D1306
Soro de burro	Sigma Aldrich	D9663
Estéril 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Microscópio de fluorescência	Leica