$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação das soluções de trabalho e buffers
NOTA: Na manhã do ensaio, prepare as seguintes soluções. Este cálculo é baseado nas soluções necessárias para processar duas regiões do cérebro (ou seja, o córtex pré-frontal [PFC] e o hipocampo [HPC]) de 12 camundongos.
- Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF, pH = 7,4) conforme mencionado em Tabela 1. Dispense 750 μL de aCSF em cada tubo de amostragem e coloque-os no bloco de temperatura de metal sobre gelo para pré-resfriar o tampão.
- Prepare o buffer de lise conforme mencionado em Tabela 2. Armazenar no gelo (400 μL a serem usados por amostra).
- Preparar uma solução de bis(sulfosuccinimidil)suberato ou de BS3 a 52 mM (26x) em tampão citrato de sódio a 5 mM (pH = 5,0).
- Primeiro, prepare 100 mM de ácido cítrico (estoque A) e 100 mM de citrato de sódio (estoque B).
- Dilua o estoque A e o estoque B na proporção de 1:20 com água deionizada. Adicione 100 μL cada a 1,9 mL de água para preparar 5 mM de ácido cítrico (estoque C) e 5 mM de citrato de sódio (estoque D), respectivamente.
- Misture 410 μL de estoque C e 590 μL de estoque D para preparar um tampão de citrato de sódio 5 mM (pH = 5,0) (solução E, 1 mL).
- Confirmar o pH da solução E com uma tira indicadora de pH.
- Dissolver 24 mg de BS3 em 806,4 μL de solução E por vórtice durante 30 s para preparar a solução-mãe de BS3 (26x).
- Prepare mais 1 mL de solução E para usar como controle de veículo para as amostras sem reticulação.
NOTA: Prepare a solução estoque BS3 quando tudo estiver pronto e o experimento estiver prestes a começar. O BS3 deve ser conservado desidratado a 4 °C até à utilização. Uma vez reconstituído, o BS3 permanece ativo apenas por aproximadamente ≤3 h. Uma vez que o pH do tampão citrato de sódio 5 mM (solução E) aumenta com o tempo, provocando uma hidrólise acelerada da BS3, recomenda-se que a solução E seja preparada fresca a partir das soluções-mãe A e B. Devido à solubilidade limitada da BS3 a baixas temperaturas, a BS3 reconstituída deve ser mantida a RT. Utilizar a BS3 reconstituída no prazo de 3 h, e não congele/descongele ou reutilize o BS3 reconstituído.
2. Dissecção de tecidos cerebrais
NOTA: A partir desta etapa, pelo menos duas pessoas devem trabalhar juntas de maneira coordenada. Enquanto uma pessoa se concentra na dissecação do animal, a outra pessoa deve trabalhar como cronometrista e ajudar a coordenar o ensaio.
- Traga o primeiro animal para dissecação da área de alojamento para a sala de dissecação.
NOTA: Como estressores agudos (por exemplo, um novo ambiente, o cheiro de sangue) podem afetar a dinâmica das proteínas cerebrais, os animais devem ser mantidos em suas gaiolas domésticas colocadas longe da área de dissecação e, em seguida, ser trazidos individualmente para a sala de dissecação para decapitação imediata.
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical seguida de decapitação. Remova o cérebro rapidamente para fora do crânio e mergulhe-o em PBS gelado em uma placa de Petri por 10-15 s (Figura 1).
NOTA: Os animais não são anestesiados para experimentos BS3, pois qualquer agente anestésico pode influenciar o nível de apresentação superficial dos receptores de neurotransmissores.
- Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral no gelo, com o lado ventral do cérebro voltado para cima (Figura 2).
- Insira a primeira lâmina de barbear na borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfatório para cortar o cérebro coronalmente (Figura 3). Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro coronalmente com intervalos de 1 mm.
- Levante as fatias coronais da matriz cerebral segurando todas as lâminas de barbear inseridas juntas, deixando a parte posterior do cérebro para trás na matriz cerebral. Use uma pinça para separar as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com a fatia do cérebro voltada para cima (Figura 4).
- Identifique as fatias que contêm a região de interesse. Para a amostragem do PFC, escolher a segunda e a terceira fatias posteriores à primeira fatia que contém o pedúnculo olfatório.
- Remova a região de interesse usando um punção de tecido, coloque-a de lado na lâmina de barbear resfriada e divida uniformemente o tecido em dois (por exemplo, tecidos do hemisfério esquerdo versus direito, com metade a ser usada para a reação de reticulação BS3 e a outra metade para o controle sem reticulação se a proteína-alvo de interesse for igualmente expressa em ambos os hemisférios).
- Pique cada tecido em pedaços na lâmina de barbear usando a ponta fina da pinça com vários movimentos verticais contra a lâmina, em vez de esmagar ou moer os tecidos. Isso maximizará a área de superfície acessível ao BS3 sem comprometer gravemente a integridade da membrana das células. Imediatamente após a picagem, transfira os tecidos picados para os tubos apropriados (consulte a etapa 3.3).
3. Reação de reticulação
- Traga o próximo animal para dissecação da área de alojamento para a sala de dissecação quando a dissecação do cérebro do camundongo anterior estiver prestes a terminar (etapa 2.10).
- Espague o tubo pré-resfriado em gelo com 30 μL de solução BS3 (26x) ou solução veicular E antes que os tecidos picados estejam prontos para serem transferidos para os tubos apropriados. Troque as pontas da pipeta entre os tubos para garantir que nenhum BS3 esteja contaminado nos tubos de controle sem reticulação.
- Transferir os tecidos picados (do passo 2.8) para os tubos apropriados e, em seguida, começar a dissecar o animal seguinte (passo 2.2).
- Inverta e misture o tubo para quebrar os pedaços de tecido em pedaços menores e comece a incubar as amostras no rotador do tubo na câmara fria por 30 minutos a 2 horas. Registre a hora de início da incubação BS3 para cada tubo. Consulte a seção de discussão para obter o tempo ideal de incubação.
- Extinguir a reação enriquecendo o tubo com 78 μL de glicina 1 M e incubar a amostra por 10 min a 4 °C com rotação constante. Registre a hora de início e término da têmpera de cada tubo. Continue ajudando a pessoa com foco na dissecação do animal, trazendo o próximo animal (etapa 3.1) e ajudando na reticulação (etapa 3.2).
NOTA: Trate cada amostra exatamente ao mesmo tempo em todas as amostras. Se a sala de dissecção estiver longe da câmara fria, é altamente recomendável que uma terceira pessoa seja recrutada para participar da incubação e têmpera da amostra na câmara fria.
Tabela 1: A composição do líquido cefalorraquidiano artificial.
| Conexão de trabalho | Solução padrão | Quantidade de solução estoque a dispensar |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2.7 mM KCl | 1.08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM Glicose | 2,5 milhões (250x) | 160 μL |
| Água deionizada | | 37.563 mL |
| Total | | 40 mL |
| * O estoque de CaCl2 deve ser preparado recentemente no dia do experimento. |
Tabela 2: A composição do tampão de lise
| Conexão de trabalho | Solução de estoque | Quantidade de solução estoque a dispensar |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10x) | 2 mL |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Coquetel de inibidores de protease | 100x | 200 μL |
| Água deionizada | | 17 mL |
| Total | | 20 mL |
