Avaliação da captação de glicose nos neurônios motores de larvas de Drosophila com metabolismo de glicose regulado positivamente

Neste artigo

Resumo

Fonte: Loganathan, S., et al., Medindo a captação de glicose em modelos de Drosophila de proteinopatia TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

O vídeo demonstra uma técnica para medir a captação de glicose em neurônios motores larvais de Drosophila usando um sensor de glicose intracelular baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Depois de dissecar as larvas para expor o cordão nervoso ventral, os neurônios motores são visualizados através da fluorescência emitida pelo fluoróforo doador do sensor. Quando estimulado com glicose, o FRET entre os fluoróforos doadores e aceptores do sensor desencadeia a emissão de fluorescência do aceptor, permitindo a comparação da captação de glicose entre larvas de controle e larvas mutantes com metabolismo de glicose regulado positivamente.

Protocolo

1. Drosophila Dissecção do Cordão Nervoso Ventral (VNC)

Faça placas de dissecação de elastômero de silicone.
1. Despeje os componentes do elastômero de silicone em um tubo de 50 mL, conforme indicado no protocolo do fabricante, e mexa bem.
2. Encha as placas de cultura de tecidos de 35 mm com aproximadamente 2 ml da mistura de elastómeros. Use uma seringa para remover quaisquer bolhas. Cubra os pratos e coloque-os sobre uma superfície nivelada em um forno a 60 ° C durante a noite para curar.
Dissecar as larvas de Drosophila para expor o VNC enquanto mantém a viabilidade do tecido.
1. Colete uma larva de terceiro ínstar errante, enxágue com ddH₂O e, em seguida, coloque-a em uma gota de tampão 3 (HL3) semelhante à hemolinfa (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM de sacarose, 5 mM de trealose, 5 mM de ácido hidroxietilpiperazina etano sulfônico [HEPES]; pH 7,1) em uma placa revestida de elastômero.
2. Usando um par de pinças (# 5 ou 55 pinças) sob um microscópio de dissecação, prenda as extremidades anterior e posterior do lado dorsal da larva para cima, esticando cuidadosamente a larva longitudinalmente com alfinetes de inseto (Minutein Pins).
3. Faça uma incisão logo acima do pino posterior usando uma tesoura de íris angular. Faça um corte vertical começando da incisão em direção à extremidade anterior da larva.
4. Adicione algumas gotas de tampão HL-3, se necessário. Remova a traqueia e o resto dos órgãos flutuantes sem perturbar o sistema nervoso central (SNC). Prenda os retalhos que esticam a parede do corpo para expor o SNC, mantendo o sistema neuromuscular (VNCs, axônios e junções neuromusculares) intacto.

2. Aquisição de imagem

Otimize os parâmetros de imagem.
1. Ligue o microscópio e os lasers antes de iniciar as dissecações. As imagens devem ser adquiridas usando um microscópio confocal vertical com uma lente de imersão em água de 40x. Use um laser de 405 nm para excitar a proteína fluorescente ciano (CFP) e adquira as imagens nos canais de detecção CFP (465-499 nm) e FRET (535-695 nm).
2. Otimize os parâmetros de aquisição, como velocidade de varredura (6), média (2), objetiva (40x), zoom (1x), tamanho do orifício (1 UA) e resolução espacial (512 x 512). Ajuste o ganho de forma que o sinal esteja na faixa dinâmica ideal. Os mesmos parâmetros devem ser usados para todos os genótipos.
Neurônios motores de imagem dentro do VNC.
1. Coloque o prato de silicone com a amostra dissecada sob a lente. Abaixe a lente para que ela entre em contato com o tampão trealose-sacarose HL3. É fundamental garantir que a lente esteja completamente submersa no buffer. Adicione mais buffer, se necessário.
2. Use os canais CFP e FRET para selecionar manualmente uma seção óptica que consiste em pelo menos 6 neurônios motores em foco, localizados ao longo da linha média do VNC. Os neurônios motores são identificados com base na expressão do sensor de glicose e na posição ao longo do eixo ântero-posterior.
3. Adquira imagens a cada 10 s por 10 min. Essas imagens representam a linha de base.
Estimule com HL-3 suplementado com glicose.
1. Remova a trealose-sacarose contendo tampão HL3 usando uma pipeta Pasteur e substitua-a por 5 mM de glicose suplementada com HL-3 (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 10 mM de NaHCO₃, 115 mM de sacarose, 5 mM de glicose, 5 mM de HEPES, pH 7,1). Esta etapa precisa ser realizada com muito cuidado, para evitar ao máximo o movimento do VNC.
2. Adquira imagens a cada 10 s por mais 10 min. Essas imagens representam a fase de estimulação.
Salve as imagens como arquivos .czi ou qualquer tipo de arquivo suportado pelo software de imagem com um nome de arquivo que inclua data, histórico genético, condição experimental (linha de base ou estimulação) e canais usados.
Reutilize os parâmetros para criar imagens de todos os genótipos (Figura 1A).

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Resultados

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Figura 1: Análise de imagem do sensor de glicose no contexto do mutante TDP-43. (A) Imagens representativas de sinais FRET e CFP em controles de sensores de glicose e amostras de TDP-43^G298S sob condições de linha de base e estimulação. Um neurônio motor representativo é descrito em cada imagem como um exemplo de ROI. Barras de escala: 20 μm. Ampliação: 40x. (B