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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Imunocoloração
NOTA: Execute todas as lavagens e incubações em um agitador de plataforma orbital ajustado para aproximadamente 100 rpm. Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, exceto a incubação de anticorpos primários, que é realizada a 4 °C. Prepare o meio de montagem com antecedência, combinando os ingredientes em um tubo de 50 mL e misturando em um nutador durante a noite. Proteger da luz e conservar a 4 °C até 2 meses. Se o sinal fluorescente endógeno for suficiente para imagem e análise sem a necessidade de imunocoloração, as etapas 1.1-1.9 podem ser ignoradas. Se pular a imunocoloração, execute três lavagens de 10 minutos em TBS e prossiga para a etapa 1.10.
- Prepare uma nova solução de TBST (0,2% Triton em TBS) adicionando 1 mL de 10% de Triton-X a um tubo de 50 mL e enchendo o tubo a 50 mL com 1x TBS. Prepare 2 mL de soluções de bloqueio e anticorpos (10% de soro de cabra em TBST) para cada cérebro.
NOTA: Para obter melhores resultados, faça TBST fresco para cada novo experimento de coloração e use uma fonte de alta qualidade de Triton-X aquoso a 10% (Tabela de Materiais).
- Rotule uma placa de 24 poços de acordo com o esquema (Figura 1). Coloque amostras diferentes em linhas diferentes e soluções diferentes em colunas diferentes. Adicione 1 mL de TBST às três primeiras colunas ('Lavagem 1', 'Lavagem 2' e 'Lavagem 3'). Adicione 1 mL de solução de bloqueio à quarta coluna.
- Prepare um palito de vidro derretendo a ponta de uma pipeta Pasteur 5,75 em um pequeno gancho usando um bico de Bunsen. Use esta palheta para transferir seções de tecido da placa de 12 poços para a coluna Wash 1 da placa de 24 poços.
NOTA: Para obter melhores resultados, filtre as seções antes de iniciar a coloração. Para rastrear seções, transfira as seções uma a uma para uma placa de Petri preenchida com 1x TBS e examine as seções usando um microscópio fluorescente com uma objetiva de 5x ou 10x para garantir que um número adequado de células marcadas com fluorescência esteja presente. Recomenda-se a coloração de quatro a seis seções por poço, embora até oito por poço possam ser coradas, se necessário.
- Lave as seções por 10 min cada em Wash 1, 2 e 3 poços, seguido de incubação por 1 h na solução de bloqueio. Use a picareta de vidro para transferir as seções de um poço para o outro. A palheta pode ser usada para transferir várias seções cerebrais de uma só vez.
- Prepare 1 mL de solução de anticorpo primário para cada amostra (por exemplo, Rabbit RFP 1:2000 ou Chicken GFP 1:2000). Adicione o anticorpo à solução de anticorpos, vortex brevemente e, em seguida, centrifugue por 5 min a ≥ 4.000 x g a 4 ° C. Incube as seções no anticorpo primário por duas a três noites a 4 ° C enquanto agita.
- Após a incubação primária de anticorpos, aspire o TBST do Dia 1 dos poços de lavagem, adicione 1 mL de novo TBST a cada poço de lavagem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Lave as seções 3x por 10 min cada.
NOTA: Para aspiração, use uma pipeta Pasteur de 9 polegadas conectada com tubulação a um frasco de vácuo. Linhas de vácuo domésticas ou uma bomba de vácuo elétrica podem ser usadas como fonte de vácuo.
- Enquanto as seções estão sendo lavadas, prepare soluções de anticorpos secundários a uma concentração de 1:200 adicionando anticorpos à solução de anticorpos (por exemplo, anti-coelho de cabra 594 ou anti-frango de cabra 488). Vórtice brevemente e depois gire por 5 min a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
- Incubar seções em anticorpo secundário por 3 h à temperatura ambiente. Proteja as seções da luz durante esta etapa e todas as etapas seguintes para mitigar o branqueamento dos anticorpos secundários.
- Após a incubação secundária de anticorpos, aspire o TBST do Dia 2 dos poços de lavagem, adicione 1 mL de novo TBST a cada poço de lavagem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Lave as seções 3x em TBST por 10 min cada.
- Durante a lavagem final, retire o suporte de montagem a 4 °C e deixe-o aquecer até à temperatura ambiente. Prepare uma mistura 2:1 de 1x TBS:água destilada e adicione a uma placa de Petri. Prepare uma lâmina de microscópio adicionando 800 μL de 2:1 TBS:dH2O à superfície.
NOTA: O uso de mídia de montagem não polimerizável é altamente recomendado. O endurecimento dos meios de montagem pode alterar o volume do tecido, o que pode confundir a análise do volume do território dos astrócitos. Uma receita para uma mídia de montagem caseira simples e barata é fornecida na Tabela de Materiais.
- Usando um pincel fino, transfira as seções uma de cada vez do poço Wash 3 para a placa de Petri. Esta etapa remove o tritão e ajuda as seções a se achatarem. Em seguida, transfira as seções da placa de Petri para o líquido na lâmina.
- Use um pincel para ajudar a organizar as seções de forma que fiquem planas no slide. Remova cuidadosamente o excesso de líquido da lâmina com uma pipeta P1000, seguida de aspiração a vácuo.
NOTA: Adicione uma ponta de pipeta P200 à extremidade da pipeta Pasteur para um controle mais preciso da aspiração a vácuo.
- Depois que todo o excesso de líquido for removido da lâmina, use uma pipeta de transferência para adicionar imediatamente uma gota de mídia de montagem a cada seção e coloque suavemente uma lamínula sobre a lâmina. Deixe a mídia de montagem se espalhar por alguns minutos e, em seguida, remova qualquer excesso de mídia de montagem que saia de baixo da lamínula por aspiração a vácuo.
NOTA: Não deixe as seções secarem antes de adicionar a mídia de montagem. Se as seções começarem a secar antes da adição do meio de montagem, isso pode afetar o volume do tecido e impedir a coleta precisa de dados.
- Sele todas as quatro bordas da lamínula com esmalte transparente. Deixe as lâminas secarem por 30 min em temperatura ambiente e depois guarde-as planas a 4 °C. Aguarde pelo menos 2 h antes de fazer imagens ou imagens no dia seguinte.
NOTA: As seções coradas com anticorpos contra GFP (proteína fluorescente verde) e RFP (proteína fluorescente vermelha) podem ser armazenadas por até 2 semanas antes da imagem, desde que estejam completamente seladas com esmalte.
