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Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Seccionamento de tecido
- Corte um pequeno pedaço do tecido (~ 1 cm x 1 cm) para seccionar. Retorne o lenço restante para gelo seco/freezer a -80 °C.
NOTA: Certifique-se de que a seção do tecido tenha ~ 95% do córtex cerebelar, onde as células de Purkinje estão localizadas.
- Coloque um monte de OCT de aproximadamente 3 mm de altura para cobrir o 'mandril'. Comece construindo as camadas no topo em um movimento lento e circular até que haja um pequeno monte.
- Quando a OCT estiver parcialmente congelada, mas ainda tiver algum líquido no centro, coloque o lenço de papel em cima dela. Não empurre o tecido profundamente para dentro da OCT. Deixe o tecido descansar em cima dele até que esteja completamente congelado, o que levará de 1 a 2 minutos.
- Colocar o «mandril» com OCT congelado e o tecido no braço de corte do criostato. Ajuste o tecido para que fique nivelado com a lâmina de corte.
- Deixe o tecido descansar no braço de corte por 15 a 20 minutos para se ajustar à nova temperatura.
NOTA: Dependendo da espessura do tecido, é necessário tempo para a aclimatação da temperatura. Deixe o tecido descansar o tempo necessário para cortar de forma limpa. Ajuste OT e CT para auxiliar na aclimatação à temperatura do tecido.
- Mova lentamente o tecido para mais perto da lâmina. Assim que o tecido atingir a lâmina, inicie o processo de corte. A espessura do corte deve ser definida para 30 μm.
- Apare 2–3x até que as camadas do córtex estejam visíveis.
- Coloque e alinhe a placa estabilizadora logo acima da lâmina do criostato.
NOTA: Uma linha prateada aparecerá da luz no criostato na interface da lâmina e da placa estabilizadora. Isso indica que a placa estabilizadora está diretamente sobre a borda da lâmina.
- Comece a cortar as seções a 14 μm. As seções cortadas corretamente serão planas sob a placa estabilizadora.
NOTA: Se o tecido estiver preso, certifique-se de que a placa estabilizadora esteja fria o suficiente. Se necessário, colocar um pedaço de gelo seco do lado de fora (lado que não toca no palco) resfriará rapidamente a placa estabilizadora.
- Corte de 4 a 6 seções e alinhe-as horizontalmente no criostato stage.
- Inclinando a lâmina, pegue todos os pedaços do tecido de uma só vez.
NOTA: Usando as escovas, levante as extremidades do lenço de papel para torná-las mais prontamente disponíveis para a lâmina após a coleta. Não pegue uma seção de cada vez. A exposição ao ar à temperatura ambiente degradará a integridade do RNA.
CUIDADO: Não deixe a membrana tocar o estágio do criostato. Se a membrana tocar o palco, ela começará a se soltar da lâmina de vidro e causará erros ao tentar o LCM.
- Vá imediatamente para a Etapa 6. Não atrase a fixação.
2. Fixação de Tecido/Visualização Stainless
- Passe imediatamente para o protocolo de fixação de etanol
- Coloque a lâmina no suporte da lâmina com etanol a 70% por 2 min - no gelo.
- Coloque a lâmina no suporte da lâmina com etanol a 95% por 45 s - no gelo.
- Coloque a lâmina no suporte da lâmina com etanol 100% por 2 min - em RT.
- Mergulhe a lâmina 3 vezes no suporte da lâmina com xileno 1 — em RT.
- Coloque o slide no suporte do slide com xileno 2 por 5 min - em RT.
- Deixe secar em local limpo por pelo menos 30 minutos. Tempos de secagem mais longos, de até 60 minutos, são ideais.
CUIDADO: Use corrediças verticais para secar em uma capela de exaustão. O xileno é volátil. Colocar as lâminas planas fará com que o xileno se acumule na seção de tecido, tornando o tecido muito escuro.
3. Descongelar slides armazenados para uso
- Remova o tubo com uma única lâmina do freezer a -80 °C 1 h antes do uso pretendido.
- Não abra imediatamente o tubo. Deixe o tubo atingir a temperatura ambiente. A condensação ocorrerá apenas na parte externa do tubo.
- Assim que o tubo atingir a temperatura ambiente e toda a condensação desaparecer (aproximadamente 30–40 min), remova a tampa e exponha a lâmina ao ar em temperatura ambiente.
- Deixe o slide se aclimatar à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Em seguida, deixe-o dentro do tubo com a tampa removida.
NOTA: O slide agora está pronto para LCM.
4. Microdissecção por captura a laser de células de Purkinje:
NOTA: Esta seção do protocolo discutirá apenas detalhes relacionados à captura de células de Purkinje para sequenciamento de RNA subsequente. Esta seção pressupõe que o usuário esteja familiarizado com o microscópio de captura a laser UV e o software afiliado.
- Limpe o microscópio stage e o braço de coleta da tampa com o descontaminador RNase.
- Com as mãos enluvadas, coloque a lâmina no microscópio e a tampa opaca de 500 μL no braço de coleta.
NOTA: Sempre garanta a técnica adequada de RNA limpando a área de trabalho com um descontaminante de RNase e usando as mãos enluvadas ao tocar na corrediça ou tampa opaca. As luvas podem ser removidas assim que a corrediça e a tampa estiverem no lugar e a captura a laser começar.
- Com baixa ampliação, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a tampa cubra toda a área visualizada na ocular.
NOTA: Apenas a ocular do microscópio mostrará se a tampa opaca está centralizada. A câmera não mostrará se a tampa está centralizada sobre o tecido. Dependendo do design do escopo de captura a laser, a visualização através da tampa opaca será apenas na ocular ou visualizada na ocular e na câmera.
- Visualize as camadas cerebelares com lente objetiva de 5x - 10x e coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e a camada de células granulares se cruzam (a camada de células de Purkinje).
- Mova para 40X e visualize as células de Purkinje.
NOTA: Consulte Figura 1 e Figura 2 para obter exemplos de visualizações.
- Comece a capturar células de Purkinje.
NOTA: Pelo menos 5 ng de RNA são necessários para realizar o sequenciamento de RNA. Aproximadamente 1600-2000 células de Purkinje produzem material de RNA suficiente para sequenciamento. O RNA ficará estável por até 8 horas no microscópio. Teste a energia UV e o foco UV antes da coleta para garantir que os níveis estejam corretos. Com o tempo, o tecido continuará a secar e a energia UV e o foco UV podem precisar ser alterados.
