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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Armazenando cérebros
- Remova rapidamente os cérebros de camundongos adultos CD1 selvagens sacrificados pesando aproximadamente 30 g usando uma abordagem convencional e congele rapidamente por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentano pré-resfriado com gelo seco.
- Armazene cérebros congelados a -80 ° C em papel alumínio ou tubos cônicos até o uso.
2. Preparando a matriz cerebral
- Vinte e quatro horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa em uma pilha de freezers descongelados. Coloque as laterais da matriz entre dois freezers, certificando-se de deixar aproximadamente 0,5 cm entre a parte inferior das ranhuras da navalha e a parte superior dos pacotes de gel (Figura 1A). Coloque papel alumínio nas extremidades para ajudar no resfriamento.
NOTA: Ao comprar uma matriz cerebral, compre uma que seja grande o suficiente para envolver todo o volume do cérebro a ser dissecado.
- Coloque a caixa contendo a matriz cerebral e os pacotes de freezer em um freezer a -20 ° C com a parte superior entreaberta durante a noite.
3. Configurando uma placa de vidro congelada
NOTA: O objetivo desta configuração é preparar uma superfície congelada para dissecar seções cerebrais.
- Coloque o gelo em uma caixa isolada até aproximadamente 5 cm do topo. Em seguida, coloque uma camada de 2,5 cm de gelo seco em cima do gelo e cubra com uma folha de plástico preta para ajudar na visualização da amostra (Figura 1B, Figura 1C).
- Coloque uma placa de vidro (deve caber apenas na abertura da caixa) em cima do plástico e coloque gelo seco em cima da placa nos cantos mais distantes (Figura 1C).
- Retire a matriz cerebral congelada do freezer e insira o cérebro a ser cortado com o lado do córtex para cima. Deixe equilibrar a temperatura na caixa por 10 min. Mantenha a tampa na caixa durante esse período.
- Ajuste a posição do cérebro na matriz com uma pinça fria para que o seio sagital e o seio transverso se alinhem com os sulcos perpendiculares do bloco (Figura 1D). Isso ajudará a garantir seções simétricas para facilitar a dissecação. Toque as pontas da pinça para secar o gelo brevemente para esfriar antes de ajustar o cérebro.
- Quando o cérebro estiver em posição, coloque uma lâmina de barbear gelada perto de seu centro e pressione a lâmina aproximadamente 1 mm no tecido. Adicione lâminas resfriadas nas extremidades rostral e caudal para ajudar a manter o cérebro no lugar (Figura 2A e Figura 2B).
- Começando na extremidade rostral, adicione as lâminas uma de cada vez, colocando-as nas ranhuras e pressionando-as suavemente para baixo no tecido aproximadamente 1 mm (Figura 2B). Continue a adicionar lâminas em intervalos de 1 mm, trabalhando em direção à extremidade caudal.
- Certifique-se de que o cérebro não mude durante esse período. Alinhe as lâminas horizontal e verticalmente (Figura 2B). Lâminas de micrótomo de baixo perfil podem ser usadas para cortar seções em larguras de 0,5 mm. Coloque-os entre as lâminas de barbear maiores (Figura 2C).
- Assim que as lâminas estiverem no lugar, pressione a parte superior do grupo com os dedos, a palma da mão ou alguma outra superfície plana (Figura 2C, Figura 2D). Balance o grupo de lâminas lentamente de um lado para o outro para movê-las através do tecido.
NOTA: Isso pode levar algum tempo (1–2 min) e requer paciência. Deve haver resistência às lâminas que se movem através do tecido. A entrada fácil significa que o cérebro está descongelando e o bloco deve ser resfriado com gelo seco.
- Quando todas as lâminas atingirem a parte inferior das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e balance para frente e para trás para trabalhar livre da matriz.
NOTA: Tenha cuidado para evitar cortar-se nas bordas afiadas das lâminas.
- Quando o grupo estiver livre, coloque a pilha, com o lado rostral para cima, na placa de vidro (Figura 2E). Coloque gelo seco ao lado e/ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação.
- Coloque a pilha com bordas afiadas para baixo na placa de vidro e separe as lâminas deslocando a pilha entre os polegares e os dedos. As lâminas devem se separar umas das outras com seções anexadas.
- Alinhe as seções na placa de vidro de rostral para caudal (Figura 2F).
- Separe o tecido das lâminas flexionando as lâminas entre os dedos ou separando com uma segunda navalha fria (Figuras 2G, 2H, 2I).
4. Dissecando seções
- Abra o Allen Mouse Brain Atlas ou outra referência e encontre pontos de referência necessários para identificar regiões de interesse. Alguns pontos de referência óbvios incluem a comissura anterior, o corpo caloso, os ventrículos laterais e o hipocampo (Figura 3).
- Vire a seção a ser cortada com uma pinça resfriada e certifique-se de que a região a ser coletada seja consistente por toda parte. Durante a colheita, consulte o atlas de referência com frequência para garantir que o ROI correto seja obtido.
NOTA: Uma lupa ou microscópio de dissecação geralmente é útil nesse processo. Uma boa iluminação também é essencial. Lâmpadas LED de baixa potência ou uma lâmpada fria podem ser usadas para essa finalidade.
- Com um bisturi ou punção limpo, corte a seção (Figura 4). Pré-resfrie cada ferramenta antes de cortar, tocando-a brevemente no gelo seco. Empurre a lâmina suavemente, mas com firmeza, no tecido, balançando-a para frente e para trás para fazer o corte. Não empurre com muita força ou o tecido irá fraturar.
NOTA: As ferramentas aquecem com o tempo. Lâminas ligeiramente aquecidas podem ajudar a fazer cortes limpos e limitar a fratura, mas tome cuidado para evitar o descongelamento do tecido. Resfrie periodicamente as ferramentas em gelo seco.
- Depois que um ROI for colhido, coloque-o em tubos de 1,5 mL pré-resfriados e rotulados. Armazene os lenços colhidos a -80 °C até que seja necessário.
