Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Cultura e carga do disco intervertebral (DIV)
- Transfira os discos intervertebrais (DIVs) para câmaras de DIV e adicione meio de cultura de DIV (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de DMEM com alto teor de glicose para o grupo fisiológico e 2 g/L de DMEM com baixo teor de glicose para o grupo patológico) + 1% de Penicilina/Estreptomicina + 2% de soro fetal de bezerro + 1% de ITS (contém 5 μg/mL de insulina, 6 μg/mL de transferrina e 5 ng/mL de ácido selênio) + 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato + 1% de aminoácido não essencial + 50 μg/mL de agente antimicrobiano para células primárias) e colocar em uma incubadora a 37 °C, 85% de umidade e 5% de CO2.
- Cultivar os discos por 4 dias dentro de um sistema de biorreator de acordo com os grupos experimentais. No grupo patológico, manter condições de carga degenerativa em 0,32-0,5 MPa, 5 Hz por 2 h/dia. No grupo controle fisiológico, utilizar um protocolo de carga de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz por 2 h/dia.
nota: Posicione os IVDs em câmaras contendo 5 mL de meio IVD durante os procedimentos de carregamento. O volume depende do tamanho das câmaras de carregamento do biorreator. Entre os procedimentos de carregamento, coloque os IVDs em placas de seis poços com 7 mL de meio de cultura IVD para recuperação de inchaço livre.
- Para analisar as mudanças na altura do disco durante o período experimental, medir a altura do disco com um paquímetro após a dissecção do DIV (linha de base) e, em seguida, diariamente após o período de inchaço livre e após carga dinâmica durante o período experimental.
2. Injeção intradiscal de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
- Diretamente após o primeiro ciclo de carregamento dinâmico no dia 1, coloque os IVDs em uma placa de Petri na posição vertical e estabilize os IVDs com uma pinça.
- Injete TNF-α recombinante (100 ng em 70 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por IVD) com uma agulha de insulina de calibre 30 no tecido do núcleo pulposo do grupo patológico. Injete lentamente a uma velocidade de aproximadamente 70 μL em 1 min.
- Após a injeção, puxe a seringa até a metade para trás dentro do DIV e puxe o êmbolo da seringa para criar um vácuo que evite que a solução injetada vaze de volta antes de remover completamente a agulha e a seringa do DIV.
NOTA: Realize um experimento piloto injetando PBS contendo corante azul de tripano para avaliar a distribuição da solução injetada após o carregamento e a cultura durante a noite.
