Indução de traumatismo cranioencefálico em modelo de rato utilizando dispositivo de percussão de fluido lateral

Resumo

Fonte: McGuire, M. J., et al. Uso de um sistema de vídeo-EEG sem fio para monitorar descargas epileptiformes após lesão cerebral traumática induzida por percussão lateral de fluido. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a indução de lesão cerebral traumática (TCE) em um rato usando um dispositivo de lesão por percussão de fluido lateral (FPI). O procedimento envolve a criação de um orifício no crânio de um rato anestesiado para expor a dura-máter, na qual uma cânula é fixada. O rato é então conectado ao dispositivo, que gera uma onda de pressão que atinge o cérebro, imitando o TCE, causando morte de células neurais e danos vasculares

Protocolo

1. Lesão por percussão fluida

1. Use jaleco ou avental cirúrgico, máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas e cobertura para a cabeça e esterilize todas as ferramentas e materiais que entrarem em contato com o local da cirurgia.
2. Anestesiar um rato Wistar macho de 10-12 semanas de idade (350-400 g) com isoflurano a 3% e 1 L / min de oxigênio em uma câmara de indução de tamanho apropriado para ratos. Remova o rato da câmara de indução e mova-o para a área de preparação quando estiver inconsciente. Coloque a pomada oftálmica estéril em ambos os olhos.
3. Raspe o cabelo da cabeça do rato com uma tesoura elétrica com uma lâmina # 40 logo acima dos olhos até a base caudal das orelhas para produzir campo cirúrgico suficiente. Remova qualquer cabelo solto e cortado do local.
4. Limpe o local da cirurgia aplicando esfoliante com clorohexidina a 2% no couro cabeludo raspado, seguido de etanol a 70%. Comece no centro e mova-se para fora em círculos concêntricos, afastando-se do local da incisão. Repita este processo 3 vezes. Aplique a solução de Betadine no local da mesma forma e deixe secar.
5. Coloque o rato anestesiado no quadro estereotáxico e mantenha a anestesia a 2-3% de isoflurano-1 L/min de oxigênio via nariz. Verifique se há perda do reflexo de retirada do membro posterior e perda do reflexo palpebral para garantir que o rato esteja em um plano cirúrgico de anestesia.
6. Monitore a frequência respiratória, frequência cardíaca, temperatura corporal e saturação de oxigênio durante toda a cirurgia. Manter a frequência cardíaca entre 300-400 bpm e SpO₂ acima de 90%.
   nota: Um oxímetro de pulso conectado a um pé traseiro pode ser usado para fornecer a leitura constante da frequência cardíaca e SpO₂. Uma frequência cardíaca acima de 400 bpm indica que o rato não está suficientemente anestesiado. Uma almofada de aquecimento autorregulável, acoplada a um termômetro retal, ajustado para 37 °C, pode ser posicionada sob o rato durante toda a cirurgia para manter a temperatura corporal. Um estereomicroscópio com uma fonte de luz em combinação com uma lâmpada de fibra óptica é útil para visualizar o procedimento.
7. Use uma agulha de 23 g para injetar cloridrato de bupivacaína a 0,5% por via intradérmica no couro cabeludo no local da incisão para analgesia local 10 a 15 minutos antes de fazer uma incisão.
8. Faça uma incisão na linha média de 1,5-2,5 cm através da pele e do músculo do couro cabeludo usando uma lâmina de bisturi # 10. Retraia a pele e o músculo para expor o crânio e fornecer um campo cirúrgico claro. Reflita a fáscia subjacente e o tecido adiposo para longe do osso com cotonetes estéreis.
   nota: Uma unidade de cautério elétrico é útil para obter hemostasia rápida.
9. Raspe a crista lateral do osso parietal esquerdo usando uma cureta cirúrgica para produzir uma superfície plana e lisa, de modo que a base do cubo Luer lock fêmea-fêmea possa ficar nivelada com o crânio.
10. Irrigue a superfície do crânio e os tecidos circundantes com 2,0 mg / mL de solução de gentamicina em solução salina estéril. Seque o excesso de solução com um cotonete estéril.
11. Aplique peróxido de hidrogênio a 3% no crânio para secar o osso.
    nota: Se o osso não estiver suficientemente seco, o cimento dentário não aderirá adequadamente e formará uma vedação sólida.
12. Crie um local de craniectomia de 5 mm de diâmetro através do osso parietal esquerdo.
    nota: Uma broca de trefina colocada em uma furadeira elétrica presa à estrutura estereotáxica pode ser útil para iniciar a craniectomia. Use uma broca manual com uma trefina de 5 mm de diâmetro para terminar lentamente a craniectomia através do osso restante. Quando estiver perto de completar a craniectomia, gire a trefina ao contrário para evitar a ruptura da dura-máter subjacente. Haverá um afinamento do crânio ao redor do perímetro do disco e a aba do crânio ficará solta quando pressionada levemente.
13. Retirar o retalho ósseo com a cureta cirúrgica e pinça de tecido liso.
    nota: Pode ocorrer algum sangramento, mas a hemostasia pode ser alcançada rapidamente aplicando uma leve pressão com cotonetes estéreis.
14. Use um estereomicroscópio e iluminação para inspecionar visualmente a dura-máter em busca de sinais de ruptura. Uma fina borda de osso permanecerá ao redor da circunferência do local da craniectomia. Remova suavemente esta borda com uma pinça de tecido liso, tomando cuidado para não romper a dura-máter.
15. Limpe o crânio com etanol a 70% para remover qualquer poeira óssea e secar o crânio.
16. Aplique uma fina camada de cola de gel de cianoacrilato ao redor da borda inferior do cubo Luer lock e prenda-o ao crânio sobre a craniectomia sem obstruir a abertura. Tenha cuidado para não colocar cola em contato com a dura-máter. Além disso, sele a trava Luer no lugar com uma fina camada adicional de cola ao redor da base externa do cubo.
17. Prepare uma pasta de cimento dentário. Aplique o cimento na superfície do crânio ao redor e sobre a base do cubo da trava Luer para prendê-lo no lugar.
18. Encha o cubo Luer lock com uma solução estéril de líquido cefalorraquidiano artificial (LCR) livre de conservantes (pH 7,4) usando uma seringa e uma agulha para que um bolus convexo de solução salina possa ser visto acima da parte superior da borda.
    nota: A solução manterá a dura-máter úmida à medida que o cimento dental seca, além de servir como uma indicação da integridade da vedação. Se o nível da solução cair, isso é uma indicação de vazamento no sistema e a trava Luer deve ser removida e substituída.
19. Assim que o cimento dentário estiver completamente curado, interrompa a anestesia com gás e remova o rato da estrutura estereotáxica.
20. Coloque o rato em uma plataforma ao lado do dispositivo FPI.
21. O dispositivo FPI possui uma ponta de metal curva que se estende do transdutor de pressão na extremidade do reservatório de fluido. Prenda um tubo de pressão de 12 cm de comprimento na extremidade da ponta curva com a extremidade oposta terminando em um conector de torção Luer lock macho de 2 cm. Prenda o rato ao dispositivo FPI conectando a extremidade fêmea do cubo no crânio do rato ao conector macho.
    nota: Certifique-se de que a conexão esteja bem presa e que todas as bolhas de ar tenham sido removidas do sistema.
22. Coloque o animal em decúbito esternal e verifique repetidamente o retorno do reflexo de retirada. Assim que o rato recuperar o reflexo de retirada, mas ainda estiver sedado, libere o pêndulo do dispositivo FPI para causar um único pulso de pressão de 20 ms e induzir a lesão.
    nota: É importante não induzir a lesão enquanto o animal estiver profundamente anestesiado, pois isso tende a causar aumento da mortalidade devido ao edema pulmonar induzido por neurogênicos. Todos os dispositivos mostram variabilidade. No entanto, no dispositivo usado para este experimento, um posicionamento de ângulo de 17 ° do martelo produz um pulso de pressão atmosférica de 2,2 a 2,3. Animais simulados e não feridos são submetidos aos mesmos procedimentos, com exceção do pulso de fluido real para induzir a lesão.
23. Desconecte imediatamente o rato do dispositivo FPI após a lesão, coloque-o em decúbito esternal e forneça oxigênio suplementar (1 L/min) por meio de um cone nasal até que a respiração espontânea retorne. A apneia é uma consequência antecipada da lesão. Se necessário, forneça respirações manuais periódicas por meio de uma máscara de válvula de bolsa até que o rato comece a respirar espontaneamente por conta própria.
    nota: Normalmente, a apneia dura menos de 2 min. Um aumento rápido e transitório da frequência cardíaca (>500 bpm) é observado imediatamente após a administração do pulso de pressão devido a uma explosão de catecolaminas. Isso pode ser monitorado com um oxímetro de pulso conectado ao pé do rato e pode servir como um possível indicador de que ocorreu uma lesão grave.
24. Monitore o rato continuamente e registre o tempo de retorno do reflexo de endireitamento (deambulação estável em todos os quatro membros).
25. A magnitude do pulso de pressão atmosférica para cada rato deve estar dentro de ± 0,05 atmosferas um do outro. Confirme se cada um dos pulsos de pressão produz um sinal suave no osciloscópio com amplitude e duração consistentes.
    nota: Um sinal ruidoso pode indicar bolhas de ar no sistema que devem ser removidas antes de fornecer o pulso de lesão. Os pulsos de pressão atmosférica que produzem uma lesão grave, neste experimento, são aqueles que normalmente resultam em tempos de endireitamento do animal de 30 a 60 min. Essa faixa de tempos de endireitamento está associada a uma taxa de mortalidade de aproximadamente 40-50%).
26. Administre 10 mL de solução salina pré-aquecida por via subcutânea como cuidados de suporte.
27. Retorne o rato à sua gaiola de origem e deixe-o se recuperar por pelo menos 4 h.
    nota: Observou-se aumento da mortalidade quando os ratos são colocados imediatamente sob anestesia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Brocas de 1,00 mm	Cidade da broca: novas ferramentas de metal duro	05M200
3M ESPE Durelon Carboxilato Cimento	3M , Neuss Alemanha	38019	Cimento Dentário
4-0 Sutura	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Sutura não absorvível trançada preta
5 mm de diâmetro externo trefina	Ferramentas de Belas Ciências	18004-50
Dumont #6 Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11260-20
Fórceps #7b Dumont	Ferramentas de Belas Ciências	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Acoplador Feminino Estilo Rosca Luer Transparente Policarbonato	Instrumento de Cole-Palmer	SKO#45501-22	Lote de pedido #214271
Furadeira elétrica de pé	Grobet USA, Carlstadt, NJ	Modelo C-300
GentaMax 100 (Solução de Gentamicina, Sulfato)	Phoenix, fabricado pela Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO		NDC 57319-520-05
Dieta de prescrição de Hill a/d Canino/Felino	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
Software IOX2	EMKA Technologies, Falls Church, Virgínia
Isoflorano, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, Índia		NDC 66794-013-25
Máquina de anestesia IsoTech	SurgiVet	WWV9000
Dispositivo FPI lateral	AmScien	302	ponta curva, com extensão de tubo de pressão. conectado via conector de trava de parafuso (Cole-Palmer; #4550-22)
Estereomicroscópio Leica A60	Leica Biosystems, Richmond, Virgínia	PN: 10 450 488
Marcaína (0,5%) Injeção de bupivacaína hcl usp 5 mg/mL	Hospira, Lake Forest, IL	CA-3627	Frasco de dose múltipla de 50mL; NDC 0409-1610-50
Pinça Micro-Adson	Ferramentas de Belas Ciências	11018-12
Porta-agulhas Olsen-Hegar com cortadores de sutura	Ferramentas de Belas Ciências	12002-14
Cimento ósseo PALACOS R+G com gentamicina	Heraeus,	REFERÊNCIA: 5036964	Cimento ósseo radiopaco contendo 1 x 0,5g de gentamicina
Solução de iodopovidona			Betadine
Pomada Veterinária Puralube	Dechra Produtos Veterinários, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Lâmina de bisturi (#10) e suporte	Integra Miltex, York, Pensilvânia	REFERÊNCIA: 4-110
Cabo de bisturi - #4	Ferramentas de Belas Ciências	10004-13
Faca de foice	Bausch + Lomb Storz Instrumentos	N1705 HM	Lâmina curva de 5 mm. Alça redonda. Comprimento total 168 mm, 6,6 polegadas.
Micro Espelho Silverstein	Bausch + Lomb Storz Instrumentos	N1706 S8	3mm de diâmetro. Ângulo de 45 graus. Comprimento total 180 mm, 7,2 polegadas
Unidade de Cauterização Térmica	Tecnologia Médica Geiger, Delasco Council Bluffs, IA	N ° de Modelo: 150
Vetivex	Dechra Produtos Veterinários, Overland Park KS		Injeção veterinária de pHyLyteTM pH 7.4 (Injeção de Eletrólitos Múltiplos, Tipo 1, USP)
Ratos Wistar IGS	Rio Charles	código da cepa 003	12 semanas no momento da lesão
Afastador de Wullstein	Ferramentas de Belas Ciências	17018-11